We herein developed an ultrasensitive PDGF-BB assay based on the aptamer-mediated In vitro transcription linked with CRISPR/Cas13 system-based signaling. In principle, this method employs hairpin aptamers to detect PDGF-BB. In the presence of PDGF-BB, the 3' end of the hairpin aptamer is opened and amplified by the complementary Guide Strand (GS) and reverse transcriptase (RTase). In GS, there is a sequence complementary to the nicking site, and after amplification, a large number of single strands are generated by the nicking enzyme (NE). RNAs complementary to crRNA are generated via In vitro transcription reaction, using T7 RNA polymerase and primers having the T7 promoter and complementary to single strands. Then introducing CRISPR/Cas13 system, trans-cleavage activity cleaves the reporter probe and emits a fluorescent signal. With this method, we successfully detected PDGF-BB down to 190 fM, with high selectivity against other proteins. Furthermore, we successfully demonstrated the practical applicability of this sensing strategy by reliably detecting PDGF-BB in the human serum.
본 학위논문에서는 압타머 유도 전사 반응과 유전자 가위 시스템 신호화 기술을 활용한 PDGF-BB 검출 방법을 개발하였다. 본 기술은 PDGF-BB를 검출하기 위해 헤어핀 압타머를 도입하였다. PDGF-BB가 존재할 때, 헤어핀 압타머의 3’말단이 열려 이에 상보적인 가닥(GS)과 역전사효소에 의해 증폭된다. GS에는 절단효소 인식부위에 상보적인 서열이 있어, 증폭된 후 절단효소의 작용으로 많은 양의 단일 가닥이 생성된다. 이 단일 가닥에 상보적이며 T7 프로모터를 갖고 있는 프라이머와 T7 RNA 중합효소를 이용하여 crRNA에 상보적인 RNA를 체외 전사 반응으로 생성한다. 이후 유전자 가위 시스템을 도입하면, 트랜스 절단 활성으로 주변의 프로브를 절단하여 형광 신호가 방출된다. 본 기술을 이용하여 PDGF-BB를 190 fM의 낮은 검출한계로 검출하였을 뿐만 아니라, 다른 단백질과 성공적으로 구분하며 높은 선택도를 입증하였다. 또한, 사람의 혈청에서도 PDGF-BB를 안정적으로 검출함으로써 본 기술의 높은 실용성을 성공적으로 증명하였다.
