Herein, we describe an alkaline phosphatase (ALP) assay based on Target-Activated Self-Primed Exponential Amplification (TASPA) reaction. This strategy employs a single self-primed EXPAR template (SET) containing the EXPAR template sequence extended by the self-priming sequence whose 3’ end is modified with phosphate. In the presence of the ALP activity, the SET is dephosphorylated and subjected to polymerase extension, producing a folded double-stranded DNA product (FP) with a nicking endonuclease recognition sequence. By the combined activities of DNA polymerase and nicking endonuclease, lots of trigger strands are produced, and they subsequently hybridize to the free SET, initiating further amplification reaction. As a consequence, a large number of FPs are produced as final products, which can be monitored by the fluorescence from the double strand-specific dye. Based on this strategy, we could successfully detect ALP activity down to 0.010 U/L with high selectivity toward ALP over other enzymes. The practical applicability of the developed strategy was also verified by reliably detecting the ALP activity in complex biological serum samples and the efficiency of ALP inhibitors.
본 연구에서는 표적에 의해 활성화되는 자가 프라이밍 증폭 반응을 이용하여 알칼리성 인산가수분해효소(ALP)의 활성을 검출하는 기술을 개발하였다. 본 기술의 핵심 구성 요소는 3' 말단이 인산기로 수정된 자가 프라이밍 엑스파 템플릿(SET)이다. SET의 인산기를 탈인산화하는 ALP의 활성 존재 시, 탈인산화된 SET의 3’말단으로부터 중합효소 신장 반응을 통해 니킹제한효소 인식 서열을 가진 접힌 이중 가닥 DNA(FP)를 생성한다. DNA 중합효소와 니킹제한효소의 활성을 통해 연속적으로 반복되는 니킹, 확장 및 치환 반응이 일어나며, 다수의 트리거 가닥을 생성하고 이들은 탈인산화 여부에 관계없이 반응하지 않은 SET의 상보적 서열에 결합하며, 더욱 증폭 반응을 일으킨다. 결과적으로, 많은 수의 FP가 생성되며 이는 이중 가닥에 특이적인 염료의 형광 신호를 통해 모니터링할 수 있다. 이러한 설계 원리를 바탕으로 우리는 다른 비대상 효소에 대한 높은 특이도와 함께 0.010 U/L까지 ALP 활성을 성공적으로 확인하였다. 복잡한 혈청 샘플에서도 ALP 활성을 안정적으로 검출하고 ALP 억제제를 검출함으로써 본 기술의 실용성을 검증하였다.
