Yeast-two-hybrid (Y2H) is most widely used system to detect protein-protein interaction (PPI), and it has greatly contributed to proteomic analysis. Proteins generally function in different ways and interact with novel proteins via post-translational modifications (PTMs), yet Y2H system cannot verify PTM-dependent interactions. Genetic code expansion (GCE) site-specifically incorporates unnatural amino acids (UAAs) into proteins with the help of orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase and its cognate tRNA, and it leads to direct expression of post-translationally modified proteins. This study accomplished site-specific acetylation on proteins and proposed the novel system, genetically expanded Y2H (GEY2H) system, to detect acetylation-dependent interaction for acetylomic analysis. Y2H system can be also used for screening peptide inhibitors of target proteins, yet its library size is small due to necessary transformation process. Warhead strategy is a traditional detour to discover authentic peptide drugs from small size of library by aiming to active sites of target proteins. 2-Amino-8-oxodecanoic acid (AODA), which is non-hydrolysable analogue, is an adequate warhead to mimic acetylation in nature and to inhibit the enzymatic activity of target proteins at the same time. Using GEY2H system which can incorporate AODA into peptides at in-frame stop codon, cyclic peptide inhibitors containing AODA have been successfully discovered. GEY2H system can be applied not only to find novel acetylation-dependent PPIs from high-throughput acetylome analysis but also to discover cyclic peptide inhibitors bearing warhead UAAs to aim to target proteins.
효모단백질잡종법은 가장 널리 사용되는 단백질-단백질 상호작용 검출 시스템이며, 상호작용체 연구에 이미 지대한 공헌을 한 바 있다. 일반적으로 단백질은 번역 후 변형에 의해 전혀 다른 기능을 수행하거나 새로운 단백질과 상호작용하는데, 기존의 효모단백질잡종법은 번역 후 변형이 일어난 단백질의 상호작용을 검증할 수 없다는 치명적 단점이 있다. 유전 코드 확장 기술은 새로운 아미노아실 tRNA 합성효소와 상응하는 tRNA의 도입을 통해 단백질의 원하는 위치에 비천연 아미노산을 삽입하도록 한다. 이를 이용한다면 번역 후 변형이 일어난 단백질을 세포 내에 정확히 발현할 수 있다. 해당 연구는 유전 코드 확장 기술을 이용해 위치 특이적 아세틸화를 효모 내에 구현하였으며, 아세틸화 여부에 따른 단백질-단백질 상호작용을 검출할 수 있는 새로운 아세틸롬 분석 시스템을 제시한다. 효모단백질잡종법은 표적 단백질의 펩타이드 저해제 개발에도 이용할 수 있다. 하지만, 형질 전환 과정이 필수이기 때문에 다른 시스템에 비해 적용 범위가 크게 작다는 단점이 있다. 표적 단백질의 활성 자리를 조준하는 탄두 전략은 작은 범위에서도 훌륭한 저해제를 찾아낼 수 있는 합리적 해법이다. 비가수분해성 아세틸화는 히스톤 탈아세틸화효소의 기질을 모방하므로 효율적인 탄두로 작용하며, 동시에 그것의 비분해성을 통해 효소의 활성을 저해한다. 해당 연구에서 제시한 새로운 효모단백질잡종법을 이용해 비가수분해성 아세틸화를 구현하였고, 성공적으로 히스톤 탈아세틸화효소의 고리형 펩타이드 저해제를 개발하였다. 해당 연구에서 제시하는 효모단백질잡종법은 대규모 아세틸롬 분석은 물론 탄두 전략을 적용한 표적 단백질의 고리형 펩타이드 저해제 개발에 유용한 도구로써 응용될 수 있다.
