Rapid, sensitive, specific, and the user-friendly nucleic acid assay is a key technique for the next generation point-of-care molecular diagnosis. However, a high-cost, labor-intensive, and complicated enzymatic amplification step is essential to achieve high sensitivity. Herein, I suggested 3-dimensional (3D) self-assembled DNA hydrogel as a cascade amplification platform for rapid and ultra-sensitive nucleic acid assay. I utilized the in situ functionalization of QDs with pt-ssDNA as an effective means to achieve both desirable luminescent properties and colloidal stability, which are required for practical FRET-based DNA assay. Furthermore, QD-DNA hydrogel was prepared via self-assembly between target-catalyzed formed multiple Y-DNAs and DNA-QDs. The QD-DNA hydrogel was DNA-programmed to be continuously formed in the presence of target DNA, and efficient FRET signals were observed. The cascade amplification, which includes target-catalyzed multiple formations of Y-DNA, self-assembly with a multivalent donor into DNA hydrogel, and efficient and hierarchical energy transfer within DNA hydrogel, improved the sensitivity from nanomolar to femtomolar level even without enzymatic amplification, and the assay time was only 1 hour. In addition, by introducing the base-pair mismatches to the stem of hairpin DNA, I successfully facilitated the TMSD kinetics specifically for target miRNA, enabling DNA-hydrogel-based miRNA. The universalness of this strategy was investigated with three different miRNA targets, and the detection limits of DNA hydrogel were all improved from nanomolar to picomolar level. Since the DNA hydrogel-based nucleic acid assay enables rapid, ultra-sensitive, and specific detection of the target without enzymatic amplification, it is expected that the proposed system would be a potential sensing tool in the field of point-of-care testing.
간편성, 신속성, 초민감성, 그리고 사용자 친화적인 핵산 분석은 차세대 현장 진단에 필요한 핵심 특성이다. 기존 핵산 분석에서 초민감성을 도달하기 위해서는 효소 기반 핵산 증폭 반응이 반드시 필요했으며, 이로 인해 노동 집약적이며 복잡한 과정과 고가의 장비가 반드시 필요하다는 한계가 있었다. 본 학위 연구에서는 신속하고 매우 민감한 핵산 분석을 위한 연쇄 증폭 플랫폼으로 3 차원 (3D) 자가 조립 DNA 하이드로겔을 개발했다. 실용적인 FRET 기반 DNA 분석에 필요한 발광 특성과 콜로이드 안정성을 모두 구현할 수 있는 효과적인 수단으로 pt-ssDNA를 사용한 QD의 in situ 개질화를 활용했다. 또한, QD-DNA 하이드로겔은 표적 촉매로 형성된 다중 Y-DNA와 DNA-QD 사이의 자가 조립을 통해 제조되었다. QD-DNA 하이드로겔은 표적 DNA가 존재할 때만 연속적으로 형성되도록 DNA 기반 프로그래밍 되었으며, QD-DNA 하이드로겔 내부에서는 효율적인 FRET 신호가 관찰되었다. 표적 촉매 Y-DNA의 다중 형성, multivalent한 FRET 주개와의 자가 조립을 통한 DNA 하이드로겔 형성, DNA 하이드로겔 내에서 효율적이고 계층적인 에너지 전달까지 모두를 포함하는 캐스케이드 증폭은 효소 기반 증폭 없이도 나노 몰에서 펨토 몰 수준으로 감도를 향상시켰다. 분석 시간 또한 1 시간으로 짧았다. 또한 헤어핀 DNA의 줄기에 염기쌍 불일치를 도입함으로써 표적 miRNA에 특화된 TMSD 동역학을 성공적으로 촉진하여 DNA-하이드로겔 기반 miRNA 검출을 가능하게 했다. 세 종류의 miRNA 표적에 대해 DNA 하이드로겔의 검출 한계는 모두 나노 몰에서 피코 몰 수준으로 향상되어 DNA 하이드로겔 기반 검출에서 해당 전략의 보편성을 확인할 수 있었다. DNA 하이드로겔 기반 핵산 분석은 효소 증폭없이 표적을 신속하고 매우 민감하며 특이적으로 검출할 수 있기 때문에 제안된 시스템은 향후 현장 진단 테스트 분야를 선도하는 핵심 기술로 자리 잡을 수 있을 것으로 기대된다.
