With the development of recombinant DNA technology, the development of therapeutic proteins has increased dramatically, and due to its high specificity and low immunogenicity, it is attracting attention as a substitute for chemically synthesized drugs. In general, Chinese hamster ovary (CHO) cells are preferred among various hosts for the production of therapeutic proteins because they ensure post-translational glycosylation and are suitable for large-scale suspension culture.Bone morphogenetic protein (BMP) are known to be essential elements that stimulate bone formation in vivo, and have the potential as therapeutic proteins that help rapid recovery during fracture and implant insertion. According to the global aging trend and the increase in the obese population, the demand for BMPs is gradually increasing, but rhBMP productivity in CHO cells is still reported to be relatively low compared to the amount of antibody production. Therefore, it is necessary to develop a large-scale culture process using CHO cell lines. Previous studies have shown that rhBMP-4 in CHO cells is uptaken intracellularly by heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) located in the cell membrane. Therefore, it is needed to find out whether rhBMP-2 and rhBMP-7, which are currently in high demand, are targets for intracellular uptake of CHO cells, and to overcome low productivity by blocking intracellular uptake. When purified rhBMP-2 and rhBMP-7 were cultured with the CHO cell line, it was observed that only rhBMP-2, not rhBMP-7, was actively internalized into the cells. Confocal microscopy analysis revealed that HSPG in the cell membrane acts as a direct receptor for this intracellular uptake of rhBMP-2. It was also found that the cell surface HSPG-mediated endocytosis of rhBMP-2 occurred through both the clathrin- and caveolin-dependent pathways. Heparin and dextran sulfate (DS), which are structurally similar to heparan sulfate (HS) chain of HSPG were used as competitive inhibitors to prevent intracellular uptake. When heparin and DS were treated with CHO-BMP-2 cells, respectively, the production amount increased by up to 19 and 22 times, respectively. In contrast, the production of rhBMP-7, which was not internalized into the rCHO cells, did not dramatically increase upon addition of DS and heparin. Recombinant growth/differentiation factor-5 (rhGDF-5) is one of the BMP family and is recognized as a potential therapeutic agent. For rhGDF-5 production, a production cell line was developed using two CHO host cells, dihydrofolate reductase (DHFR) positive CHO-K1 and DHFR-deficient DG44. In adherent culture, rhGDF-5 molecules were shown to be significantly degraded with the decay phase only in DG44-derived clones. Therefore, CHO-K1-derived GDF-5 producing clones were selected as appropriate rhGDF-5 producing cells. Afterwards, 7 members of proprotein converatases (PCs) was transiently expressed to find appropriate PCs for rhGDF-5 maturation. Among them, cell membrane anchored PC5/6 or PC5/6ΔC which can be secreted from cells, were efficiently induced rhGDF-5 maturation as much as furin. As a result, a clone overexpressing PC5/6ΔC was constructed to increase the yield of mature rhGDF-5 in adherent culture.In previous studies, it was observed that intracellular uptake of BMPs resulted in a decrease in productivity in CHO cells, and heparin or DS effectively enhanced production by interfering with intracellular uptake. Based on this, it was investigated whether rhGDF-5 was uptaken by CHO cells, and the relationship between the chain length of HS and the internalization of rhGDF-5 was studied. Purified rhGDF-5 was incubated with CHO cell to confirm the cellular uptake of rhGDF-5 by FACS and confocal microscopy analysis. This endocytosis is mediated by HSPG, and the length of the HS chain played an important role in introducing rhGDF-5 into the cell. Therefore, short-length of heparin or DS could not interfere with the cellular uptake of rhGDF-5 by HSPG at all, or high doses of them were required to prevent the internalization. The longer the length, the greater the blocking effect of internalization, and the blocking effect occurred even at a low concentration of long-length of heparin or DS. Unfractionated heparin or 40, 200 kDa of DS, found out through screening assay, were treated with CHO-GDF-5 cells and the maximum productivities were enhanced by 10-, 6- and 11-times, respectively.
재조합 DNA 기술의 발달로 치료용 단백질의 개발이 극적으로 증가했으며, 높은 특이성과 낮은 면역원성으로 인해 화학적 합성 약물의 대체제로서 각광을 받고 있다. 일반적으로 치료용 단백질 생산을 위한 다양한 숙주 중에서 Chinese hamster ovary (CHO) 세포가 선호되는데, 번역 후 당화를 보장하고, 대규모 부유 배양에 적합하기 때문이다.골 형성 단백질 (Bone morphogenetic protein, BMP) 계열 단백질들은 생체 내에서 뼈 형성을 자극하는 필수 요소로 알려져 있으며, 골절 및 임플란트 삽입 시에 빠른 회복을 돕는 치료용 단백질로써의 잠재력을 가지고 있다. 세계적인 고령화 추세와 비만인구 증가에 따라서 그 수요가 점차 증가하고 있다. 따라서 CHO 세포주를 통한 재조합 인간 유래 BMP 생산 (rhBMP) 세포주 개발 및 대용량 배양 공정 개발이 필요하다.이전 연구를 통해 CHO 세포에서 rhBMP-4가 세포막에 위치한 헤파란 설페이트 프로테오 글리칸에 의해 세포내 섭취가 된다는 사실이 밝혀졌다. 따라서 현재 수요가 가장 높은 rhBMP-2와 rhBMP-7가 CHO 세포의 세포내 섭취의 타겟이 되는지 알아보고, 세포 내 섭취를 막아 낮은 생산성을 극복하고 자 하였다. 정제된 rhBMP-2와 rhBMP-7를 CHO 세포주와 함께 배양시켰더니, rhBMP-7가 아닌 rhBMP-2만 세포내로 활발히 흡수되는 것을 관찰하였다. 세포막의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸이 이 세포내 섭취에 직접적인 수용체로 작용한다는 것을 컨포컬 마이크로스코피 분석을 통해 밝혀내었다. 또한 다양한 세포 내 섭취 경로 가운데에 Clathrin 와 Caveolin 의존성 경로를 모두 경유할 수 있음을 알아내었다. 헤파란 설페이트 프로테오글리칸의 헤파란 설페이트 사슬의 구조와 유사한 헤파린과 덱스트란 설페이트를 경쟁적 저해제로 사용하여 세포 내 섭취를 방해하고자 하였다. 헤파린, 덱스트란 설페이트를 각각 rhBMP-2 생산 CHO 세포주에 처리하였더니, 생산량이 각각 최대 19배, 22배 가량 증가하였다. 세포내 섭취의 타겟이 되지 않는 rhBMP-7의 경우 세포주에 헤파린과 덱스트란 설페이트를 처리하였을 때 큰 생산량의 증가를 얻을 수 없었다.재조합 성장/분화인자-5 (rhGDF-5)는 BMP 계열 중 하나로 잠재적 인 치료제로 인식되고 있다. rhGDF-5 생산을 위해 2 개의 CHO 숙주 세포, 디하이드로 폴레이트 환원 효소 (DHFR) 양성 CHO-K1, DHFR- 결핍 DG44를 이용해 생산 세포주를 개발하였다. 세포 부착 배양에서 rhGDF-5 분자는 DG44-유래 클론에서만 성장의 쇠퇴 단계와 함께 상당히 분해되는 것으로 나타났다. 따라서 CHO-K1 유래 GDF-5 생산 클론을 적절한 rhGDF-5 생산 세포로 선택하였다. 이후 rhGDF-5 성숙 과정에 필수적인 단백질 전환 효소 (Proprotein convertase) 를 찾기 위해 7 종류의 단백질 전환 효소를 임시 발현하였고, 이 가운데에 세포막에 고정 발현되는 PC5/6 또는 세포 밖으로 분비가 가능한 PC5/6ΔC는 성숙 GDF-5 프로세싱을 효과적으로 유도하였다. 결과적으로 PC5/6ΔC를 과발현 하는 클론을 구축하여 부착 배양 성숙 rhGDF-5의 수율을 증가시켰다.이전 연구를 통하여 BMP 계열 단백질의 세포 내 섭취가 결과적으로 생산성을 감소시키며, 헤파린이나 덱스트란설페이트가 세포 내 섭취를 방해하여 생산량을 효과적으로 증대시키는 것을 관찰하였다. 이를 바탕으로 BMP 계열 rhGDF-5의 세포 내 이입 여부를 파악하고 헤파란 설페이트 프로테오 글리칸의 사슬 길이와의 이입 현상의 연관성에 대해 연구하였다. 정제된 rhGDF-5를 CHO 세포주와 함께 배양시켜 rhGDF-5의 세포 내 이입을 FACS 및 컨포컬 마이크로스코피 분석을 통해 확인하였다. 이러한 세포내 이입은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 의해서 이루어지며, 헤파란 설페이트 사슬 길이가 rhGDF-5를 세포 내 이입시키기 위한 큰 요소로 작용하였다. 따라서 길이가 짧은 헤파린이나 덱스트란 설페이트로는 HSPG에 의한 rhGDF-5의 세포 내 이입을 전혀 방해할 수 없거나 높은 농도가 필요하였다. 길이가 길수록 세포 내 이입의 차단효과가 컸으며, 길이가 길면 낮은 농도에서도 차단 효과가 일어났다. 이러한 스크리닝을 통해 얻은 분절되지 않은 헤파린 또는 40, 200 kDa의 덱스트란 설페이트를 rhGDF-5 생산 세포주에 처리하여 최대 생산량이 각각 10배, 6배, 11배 가량 증가하는 높은 수득률을 얻었다.
