Plants and several organisms use light energy and converts them into another form of energy, for performing several functions. Therefore, in order to regulate the functions in response to light by plants and organisms, so-called “photoreceptors” (proteins) are used. Phototropins are photoreceptors, which performs the function of Phototropism in addition to the functions like stomatal opening, chloroplast movement in higher plants. Phototropins responds to blue-light and exist, as isoforms (Phototropin 1 and Phototropin 2) in higher plants.LOV2 domain from Phot 1, is one such example that responds to blue light and involves in activation of kinase domain. Similarly, PYP like photoreceptors of also responds to blue-light and involves in the negative phototaxis of E.halophila. Number of domains together constitute a photoreceptor protein, which responds to light and controls the function by interacting with each other. LOV2 domain interacts with LOV1 domain and tranduces the signal to the kinase domain. PYP on the other hand, is a small protein that stands as a prototype for the PAS domains (which has multidomain architecture) and involves in signal transduction in response to changes with the environment and to changes within the cell. LOV2 domain switches from dark state to light adapted adduct state (Flavin mononucleotide (FMN)-cysteinyl adduct). Upon irradiation with blue light, pCA (p-coumaric acid-cofactor), which is a chromophore of PYP, undergoes photoisomerisation.. These kind of photoreceptors are in the lime light of research, since, the conformational changes of these photoreceptors when “controlled by light”, would pave the way for production of “optogenetic tools”. The structural changes associated conformation dynamics of As LOV2-J$\alpha$ and As LOV2-$\Delta$J$\alpha$ domains were studied using Transient Grating (TG) and Transient Absorption (TA) spectroscopies. Based on the fitting results of decay profiles monitored at 660nm we found that FMN-Cysteinyl adduct formation in As LOV2-J$\alpha$ and As LOV2-$\Delta$J$\alpha$ domains occurs with time constants of 2.2 and 2.1 $\mu$s, respectively. The dark recovery rate from the fitting result was 110s for both domains, which indicates that the J$\alpha$ truncation did not alter the recovery rate. The changes in Diffusion coefficient was measured using TG spectroscopy to observe the conformational changes (spectrally silent features) that occurs after the adduct formation. Based on the D value, As LOV2-J$\alpha$ and As LOV2-$\Delta$J$\alpha$ domains exist as monomer and dimer in the dark state respectively. The As LOV2-J$\alpha$ domain undergoes photoinduced dimerization (1.2ms), by the photoinduced association of ground state domain with photoinduced domain, which then follows with J$\alpha$ helix unfolding. The As LOV2-$\Delta$J$\alpha$ forms monomer (0.98ms) upon photoinduction proceeding with minor structural arrangements within the core. Therefore, the J$\alpha$ helix controls the equilibrium shift between monomer and dimer of the LOV2 domain. On the other hand, the effect of N-terminal extension (by length and sequence) on the photocycle of PYP studied using Transient absorption spectroscopy showed that, the Dark recovery (pB2to pG) was accelerated when compared to wild-type PYP,by extending the length (5G-PYP, 15G-PYP, 20G-PYP) of N-terminal. Only transient state that is being altered by extending N-terminal of PYP is pB2topG. Therefore, the lifetime of the transient signaling state (pB2topG) could be regulated by extending the N-terminal.
식물을 비롯한 여러 생명체는 다양한 기능을 하기 위해서 빛 에너지를 이용하고 이를 다른 형태의 에너지로 변환한다. 식물 등의 생명체가 빛에 반응하여 기능을 조절하기 위해서 “광수용체”라는 단백질을 이용한다. 포토트로핀(phototropin)은 식물의 굴광성이나 기공을 여는 작용 및 엽록체 이동 등에 연관된 광수용체로서 푸른색 빛에 반응한다. 고등식물에서는 두 종류의 동형 단백질(phototropin 1과 phototropin 2)로 존재하는데 그중 포토트로핀1의 LOV2 도메인 단백질은 푸른색 빛에 반응하며 키네이즈(kinase)의 활성화에 관여하는 광수용체로의 하나로 알려져 있다. 비슷하게 박테리아(Halorhodospira halophila)에서 비롯된 광활성 황단백질(photoactive yellow protein; PYP) 역시 푸른색 빛에 반응하는 광수용체로 박테리아의 음광주성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 광 수용체 단백질은 빛에 반응하는 도메인과 서로간의 상호작용을 통해 기능을 조절하는 여러 개의 도메인으로 구성되어 있다. LOV2 도메인은 LOV1 도메인과 상호작용을 하고 생체 신호를 키네이즈 도메인으로 전달한다. 반면에 PYP는 다중 도메인 구조의 일부인 PAS 도메인의 원형(prototype)인 작은 단백질로, 세포 안과 밖의 환경 변화에 반응하여 생긴 생체 신호 전달에 연관되어 있을 것이라 추정되고 있다. LOV2 도메인은 어두운 상태(dark state)에서 Flavin mononucleotide (FMN)과 시스테인 사이의 결합을 가지는 광적응 결합체(light-adapted adduct state)로 전환된다. PYP의 발색단인 p-coumaric acid(pCA)은 푸른색 빛을 흡수하여 광이성질화를 나타낸다. 이러한 종류의 광수용체들은 빛에 의해 구조 변화를 컨트롤 할 수 있기 때문에 광유전학적 도구(optogenetic tool)의 제조를 위한 연구 대상물질로서 주목을 받아 왔다. 본 연구에서는 As LOV2-J$\alpha$와 As LOV2-$\Delta$J$\alpha$의 구조 동역학을 과도 격자(transient grating)와 과도 흡광(transient absorption) 분광법을 통해 단백질의 구조 변화를 연구하였다. 450 nm 빔을 이용한 광여기후 660 nm에서 측정한 시간에 따른 과도 흡광 감쇄를 피팅하였을 때, As LOV2-J$\alpha$와 As LOV2-$\Delta$J$\alpha$는 각각 2.2와 2.1 $\mu$s의 시간 상수로 FMN과 시스테인 사이의 결합 형성됨을 확인하였다. 두 도메인의 어두운 상태로 회복되는 속도는 110 s로 피팅되었는데, 이는 J$\alpha$를 잘라도 회복 속도에 영향을 미치지 않았음을 의미한다. 결합형성 이후 흡광 분광법으로 측정이 어려운 구조 변화를 측정하기 위해서, 과도격자 분광법을 통해 분자의 확산 계수(diffusion coefficient)의 변화를 확인하였다. 확산 계수를 통해 As LOV2-J$\alpha$와 As LOV2-$\Delta$J$\alpha$가 각각 어두운 상태에서 단량체(monomer)와 이량체(dimer)로 존재하는 것을 알 수 있었다. 하지만 As LOV2-J$\alpha$는 광반응을 통해 1.2 ms의 시간 상수로 이량체화(dimerization)가 일어나고 이후에 J$\alpha$ 나선의 펼침 과정이 일어났다. 한편 이량체인 As LOV2-$\Delta$J$\alpha$는 0.98 ms의 시간 상수로 단량체가 된 후 중심 부분에서 작은 구조 변화가 일어났다. 이러한 결과는 J$\alpha$ 나선이 LOV2 도메인의 단량체와 이량체 사이의 평형에 관여하고 있다는 것을 의미한다. 한편 아미노말단에 추가된 아미노산의 길이와 종류가 PYP 광순환반응에 주는 효과를 과도 흡광 분광법으로 연구한 결과, 아미노말단의 길이가 늘어나면(5G-PYP, 15G-PYP, 20G-PYP) 야생형 PYP와 비교했을 때 어두운 상태로의 회복(pB2 상태로부터 pG 상태로 회복)이 가속화됨을 알 수 있었다. 광반응 단계 중 아미노말단을 연장하였을 때 영향을 받은 것은 이 어두운 상태로 회복되는 과정뿐이었다. 이를 통해 아미노말단의 연장을 통해 PYP의 신호 상태로 추정되는 pB2 상태의 수명 (lifetime)을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
