Most protein-coding genes are transcribed by RNA polymerase II (Pol II) in eukaryotic cells. To overcome obstacles exerted by chromatin, Pol II constantly removes histones and proceeds with transcription. Cumulative evidence indicates reassembly of evicted histones by chromatin factors, a mechanism known as histone turnover, to maintain proper chromatin structure during transcription. In this study, to understand the molecular details about histone turnover in Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), a replication-independent histone turnover assay was established through incorporation of newly synthesized histones into chromatin. Significant histone turnover was observed in nucleosome-free regions (NFRs) and showed high correlations with transcription rate. The patterns of histone turnover were categorized into three clusters and some genes of cluster3 appeared to be subjects of DNA replication- and transcription-independent histone turnover. Interestingly, histone marks such as H3K56 acetylation (H3K56Ac) and H4K20 monomethylation (H4K20me1) were localized at NFRs and these marks were highly correlated with expression levels. Genome-wide profiles of H3K56Ac were similar between S. pombe and Saccharomyces cerevisiae. Surprisingly, the genome-wide occupancy of H4K20me1 overlapped with H3K56Ac occupancy. In set2 and alp13 mutants, aberrant antisense transcripts were produced at coding regions, possibly due to histone turnover. In genome-wide ChIP-seq, levels of H3K56Ac and H4K20me1 in set2 and alp13 deletion cells were found to be increased compared to wild-type, indicating that H4K20me1 may serve as a histone turnover mark in S. pombe, in addition to H3K56Ac.
A correlation between histone turnover, H3K56Ac and H4K20me1 was assessed in asynchronized cells. H3K56Ac showed a positive correlation with histone turnover, in both synchronized and asynchronized cells, whereas H4K20me1 showed strong correlations with histone turnover when the experimental conditions were similar. These findings indicate that H3K56Ac stands for histone turnover in both replication-dependent and -independent manners while H4K20me1 only serves as a mark in a transcription-dependent manner.
대부분의 진핵 세포 유전자들은 RNA 중합효소에 의해서 RNA로 전사된다. RNA중합효소II는 조밀한 크로마틴 구조로 인해서 전사진행이 어려워지는데 그것을 지속적인 히스톤 제거로 극복한다. 이렇게 제거된 히스톤들은 전사 동안 적절한 크로마틴 구조를 유지하기 위하여 크로마틴 조절 인자들에 의해 다시 뉴클레오좀으로 만들어지게 되어있다. 그 중 잘 알려진 방법이 염색질 교환방법이다. 이번 연구에서 염색질 교환에 대한 분자적인 이해를 위해 새롭게 생성되는 히스톤이 크로마틴에 들어가는 것을 측정하는 방식의 DNA복제 비의존적 염색질 교환 실험을 분열효소에서 수행하였다. 이 실험을 통해Nucleosome free region(NFR)에서 염색질 교환이 많이 일어나는 것과 염색질 교환이 전사가 많이 일어나는 곳에 더욱 활발하게 일어난다는 것을 관찰하였다. 염색질 교환의 정도에 따라 k-means 분석방법을 통해 세 개의 그룹으로 나누었다. 그 중 세 번째 그룹의 몇몇 유전자들은 염색질 교환이 DNA복제 비의존적, 전사 비의존적으로 일어나는 것을 알 수 있었다. 흥미롭게도 H3K56Ac과 H4K20me1이 염색질 교환이 많이 일어나는NFR에 존재하고 염색질 교환과 비슷하게 유전자 발현 정도 따라 관계성을 보였다. H3K56Ac은 출아효모에서 염색질 교환의 표시자로 알려져 있다. 그 사실을 바탕으로 출아효모와 분열효모의 H3K56Ac을 Genome-wide하게 비교했다. 그 결과 출아효모와 분열효모의 H3K56Ac은 위치뿐 아니라 유전자 발현에 따라 구분 되는 것까지도 유사하였다. 그리고 H4K20me1와 H3K56Ac가 Genome-wide상에서 거의 동일한 위치에 존재하는 것을 보았다. 한 편 Set2와 Alp13이 제거된 분열효모에서는 활발한 염색질 교환으로 잘못된 antisense RNA가 유전자 내에서 만들어지게 되는데 이 사실을 바탕으로 Set2와 Alp13이 제거된 분열효모에서 H3K56Ac과 H4K20me1이 어떠한지 Genome-wide ChIP-seq을 통해 관찰하였다. 그 결과 Set2와 Alp13이 제거된 분열효모에서 정상 효모보다 유전자 내에서 H3K56Ac과 H4K20me1 의 양이 증가를 보였는데 이것은 염색질 교환이 활발히 일어나는 유전자 내에 H3K56Ac과 H4K20me1가 많이 존재한다는 것을 의미한다. 이러한 결과들을 통하여 H4K20me1이 H3K56Ac과 같이 염색질 교환의 표시자 역할을 한다는 결론을 얻었다.
또한 세포주기가 계속해서 진행되는 상황에서 염색질 교환과 H3K56Ac과 H4K20me1의 관계를 살펴보았다. 이전 연구들과 동일하게 H3K56Ac은 세포주기가 계속 진행되는 상황이든 그렇지 않은 상황이든 상관없이 염색질 교환과 높은 연관성을 보인 반면에 H4K20me1는 염색질 교환 실험의 세포가 자라는 조건과 가까울수록 예를 들면 세포가 자라는 온도가 같거나 세포주기가 같거나 하는 경우 더욱 높은 연관성을 보였다. 이러한 결과들로부터 H3K56Ac은 DNA복제 의존적인 상황이든 비의존적인 상황이든 상관없이 염색질 교환의 표시자로 역할을 하지만 H4K20me1는 오직 전사 의존적인 상황에서만 염색질 교환의 표시자로서 역할을 할 수 있다는 것을 알 수 있다.
