For the purpose of high production of L-tryptophan using Escherchia coli, various mutant strains were developed and optimal fermentation conditions were investigated. Recombinant microorganism, E. coli W3110tnaΔtrpEA[pCRT185], accumulated about 0.03 g/l of L-tryptophan after cultivation for 38 hr in a jar fermentor. Since only small amount of L-tryptophan was produced by this recombinant cell may be due to the complex regulatory function in L-tryptophan biosynthesis, analogue resistant mutants were derived from the prototype E. coliW3110. Among various analogues tested 5-methyltryptophan, 5-fluorotryptophan, β-thienylalanine were found to be very effective and these analogues were used to release the feedback inhibition and the feedback repression of tryptophan biosynthesis by the end products of aromatic amino acid pathway. Mutant strain SB 1007 resistant to these analogues was isolated and strain SB 1007 produced 0.76 g/l of L-tryptophan in the test tube culture. Furthermore in order to increase the metabolic flux of tryptophan specific pathway from chorismate, double auxotrophic mutant SE 2756 strain was derived from the strain SB 1007 by blocking the side-pathway to phenylalanine and tyrosine. SB2756 strain accumulated 2.6 g/l of tryptophan in the test tube culture. The effects of the precursors on L-tryptophan production were examined using mutant strain SB 1007. Both anthranilate and indole inhibited the cell growth and production of L-tryptophan reduced. Therefore various surfactants have been used as reservoirs of precursors. Among the nonionic surfactants tested, Triton X-100 was found to be very effective for L-tryptophan production. When the strain SB 1007 was cultivated in shake-flask in the fermentation medium containing 1.0 g/l of indole and 2% (volume%) of Triton X-100, L-tryptophan production was increased about 2.5 times compared with control value. The effect of oxygen supply and of the temperature on L-tryptophan production were investigated using SB 1007 strain in a jar fermentor. Optimal conditions were found to be 1.3 vvm, 800 rpm, and 35℃ for aeration, agitation, and temperature, respectively. Under these optimal conditions after 36 hr jar fermentation SB 1007 strain accumulated 3.5 g/l of L-tryptophan, about five times greater than that obtained from the test tube culture. In order to assess the potential for improvement in tryptophan production by E. coli the theoretical conversions of glucose and ammonia have been calculated. The maximum theoretical conversion yield of tryptophan from glucose was 0.04973 g-tryptophan/g-glucose. The product yield of strain SB 1007 was found to be about 8-9% of theoretical maximum value.
대장균을 이용하여 다량의 tryptophan을 생산하기 위하여 여러가지 변이주를 개발하고 최적 발효 조건을 찾는 연구를 하였다.
재조합 미생물인 E. coli W3110 tna Δ trp EA [pCRT185] 는 2 l 크기의 원통 발효조에서 38 시간 배양된 후에 (0.03 g/l의 L - tryptohan)을 축적하였다. 이러한 재조합 미생물에 의해 소량의 L tryptophan만이 생성된 것은 트립토판 생합성에 있어서 복잡한 조절작용 (regulatory funotion)에 기인할 것이라 생각하고 대장균의 prototype E. coli W3110으로부터 analogue에 내성을 갖는 균주를 유도하였다. 여러가지 analogue 들중에서 5 - methyltryptophan, 5 - fluorotryptophan, 그리고 β - thienylalanine 이 analogue 효과가 가장 우수했으며 이러한 analogue 는 tryptophan생합성에 있어 방향족 아미노산들에 의한 feedback inhibition 및 feedback repression을 해제하는데 사용되었다. 이러한 analogue 들에 내성을 갖는 균주 SB 1007 을 개발하였고 이때 SB 1007 균주는 시험관에서 배양된 결과 0.76 g/ℓ의 tryptophan을 축적하였다. 더우기 chorismate로부터 tryptophan - specific 경로에로의 생합성 양 (metabolic flux)을 증가시키기 위하여 SB 1007균주를 모균주로 하여 phenylalanine과 tyrosine으로 진행되는 경로를 차단함으로써 double auxotroph균주인 SB2756를 유도하였다. SB2756균주는 시험관에서 배양된 결과 2.6g/ℓ의 tryptophan을 축적하였다. 트립토판 생성에 있어서 전구체의 효과를 조사하기 위해서 antranilate 또는 indole을 포함한 배양액에서 SB1007균주를 배양하였다.
Anthranilate나 indole 모두 세균의 증식을 억제하였고 tryptophan생성도 감소시켰다. 이러한 이유로 해서 여러가지 계면활성제가 전구체들의 답체로 사용되었는데 이중에서 Triton X- 100이 tryptophan 생성에 있어서 가장 효과적이었다.
1g/ℓ의 indole과 2% (부피 2%) 의 Tritan X-100을 포함한 배양액을 넣은 shake-flask 에서 SB1007균주가 배양되었을때 indole과 Tritan X-100을 넣지 않았을 때에 비하여 tryptophan 생성이 2.5배 가량 증가하였다.
Jar fermentor 에서 SB 1007 균주를 사용하여 L - tryptophan 을 생성하는데 있어서 산소공급과 온도의 효과에 대해 연구하였다. 최적 발효조건은 통기량이 1.3 VVM 이었고 교반속도는 800rpm 이었으며 온도는 35℃이었다.
이러한 최적조건 아래서 36시간 동안 jar에서 발효시킨 결과 SB 1007 균주는 3.5g/ℓ의 L - tryptophan을 축적하였는데 이는 시험관에서 배양한 결과보다 대략 5배 가량 증가한 것이다. 대장균에 의한 최대 tryptophan 생성량을 추론하기 위하여 포도당과 암모니아로부터의 이론적인 최대 전화율을 계산한 결과 포도당으로부터 tryptophan으로의 최대 이론 전화율은 0.4973 g - tryptophan /g-glucose이었다. SB 1007 균주의 생산율 (product yield)은 최대이온 전화율이 8~9%이다
