Oxidative stress is deeply involved in various neuronal diseases including neurodegenerative diseases, stroke and ischemia/reperfusion injury. I observed that $H_2O_2$ induced poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)-dependent necrotic cell death which was prevented by diphenyleneiodonium (DPI) pretreatment. It was shown that DPI prevented the cell death by inhibiting mitochondrial respiratory chain complex I among various flavoproteins that can be inhibited by DPI, as a specific inhibitor of mitochondrial complex I, rotenone, prevented $H_2O_2$-induced cell death. In search of the preventive effects of inhibitors of mitochondrial complex I, I detected mitochondrial hyperpolarization and subsequent intracellular generation of reactive oxygen species (ROS) triggered by exogenous $H_2O_2$. DPI and rotenone inhibit both. $H_2O_2$ also induced c-Jun N-terminal kinase (JNK) phosphorylation in biphasic pattern, of which only the second peak was inhibited by DPI pretreatment. JNK inhibitor blocked mitochondrial hyperpolarization and intracellular ROS generation, whereas PARP inhibitor did not block mitochondrial hyperpolarization. In vivo study of middle cerebral artery occlusion model implied protective effect of DPI and rotenone in ischemia/reperfusion injury. In summary, I suggest that when oxidative stress is given, JNK phosphorylation, mitochondrial hyperpolarization and intracellular ROS generation form a vicious cycle, leading to PARP over-activation and eventually to cell death. Inhibition of mitochondrial complex I could break the vicious cycle and prevent oxidative stress-induced cell death, and it had a potential capability of therapeutic interventions in oxidative stress-induced neuronal diseases.
산화성 스트레스는 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중 또는 허혈/재관류 뇌 손상 등의 여러 뇌질환에 깊게 연관되어있다. 뇌세포에 산화성 스트레스를 유발하는 과산화수소를 처리하였을 때, poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)에 의한 세포 괴사가 발생하였고, 이는 다시 diphenyleneiodonium (DPI) 를 이용해 막을 수 있었다. DPI는 플라보단백질 억제제인데, 세포 내에는 여러 플라보단백질이 있으므로 각각의 단백질에 대한 억제제를 통해 어떤 플라보단백질이 과산화수소로 인한 뇌세포 괴사에 관여하는지 알아보았다. 후보로 정한 세 단백질 중 미토콘드리아 전자전달계 복합체 I에 작용하는 억제제인 rotenone이 과산화수소로 인한 세포 괴사를 막았고, 이를 통해 DPI의 효과 역시 미토콘드리아 복합체 I에 작용한 것임을 짐작할 수 있었다. 미토콘드리아와 세포 괴사의 관계를 알아보기 위해 과산화수소를 처리한 후 미토콘드리아 막 전위를 관찰한 결과, 알려진 바와 다르게 막 전위의 증가가 관찰되었다. 또한, 이런 막 전위의 증가는 세포 내 활성산소종 생성의 증가를 유도하는 것으로 나타났다. 미토콘드리아 복합체 I의 억제제인 DPI와 rotenone은 막 전위와 활성산소종 생성의 증가 모두를 막았다. 과산화수소에 의한 뇌세포 괴사가 c-Jun N-terminal kinase (JNK)에 영향을 받음을 화학 억제제로 알아본 후, JNK의 인산화 경향을 알아본 결과, 이중 인산화 형태를 보였다. 이 중 두 번째 인산화 과정만이 DPI에 의해 막혔다. JNK의 화학 억제제는 미토콘드리아 막 전위의 증가와 세포 내 활성산소종의 증가를 모두 막았지만, PARP의 억제제는 막 전위의 증가를 막지 못하였다. DPI와 rotenone은 중간대뇌동맥 폐쇄 모델을 이용한 쥐 생체 실험에서 허혈/재관류 뇌 손상을 억제하였다. 결과를 정리하면, 산화성 스트레스로 인한 JNK의 인산화, 미토콘드리아 막 전위의 증가와 세포 내 활성산소종 생성의 증가는 악순환을 이루고, 결과적으로 생성되는 JNK의 이차 인산화 또는 활성산소종으로 인한 DNA의 손상은 PARP를 활성화시켜 뇌세포 괴사에 이르게 한다. 미토콘드리아 복합체 I의 억제는 미토콘드리아 막 전위 증가를 막음으로써 위의 악순환을 끊고 뇌세포를 산화성 스트레스로부터 보호할 수 있다. 나아가 미토콘드리아 복합체 I의 억제제는 산화성 스트레스로 인한 뇌손상에 대한 치료제로도 응용될 수 있음을 본 연구는 시사하고 있다.
