Classical whole-cell mutagenesis based on iterative random mutation and analogue specific screening has achieved great success in development of many industrial fermentation strains. During each iterative random mutation and selection, a mutant of improved or desired property is identified and the single best performer is taken forwards. However, in proportion to recursive mutagenesis, it has the serious disadvantage of accumulation of uncharacterized secondary mutations that are detrimental to their performance. For reconstruction of optimal amino acid over-producing strain which has desired property without detrimental mutations, we developed a simple and generally applicable method for the isolation of threonine and lysine producing mutant harboring positive relevant gene fragment on the indicator solid plate screening system without analogue oriented selection. Based on the metabolic pathway analysis, we reconstructed the metabolic map for L-threonine and L-lysine biosynthesis, and selected the target genes which might be crucial for construction of an L-threonine and L-lysine overproducing strain, respectively. Of the tested target genes, the four genes, aspC, ppc, lysC, and thrABC, exhibited the positive effect on the production of amino acid. In controlled flask fermentations, introduction of mutated ppc, lysC, and thrABC resulted in an increase of L-threonien and L-lysine, respectively. It is anticipated that the approach developed here can be used for development of an amino acid-overproducing strain.
산업용으로 사용되는 많은 생산균주들은 전통적으로 반복적인 돌연변이의 유발과 특이 analogue를 통한 선별과정을 거쳐 개발되어 왔다. 하지만 이런 반복적인 돌연변이 유발과 선별과정을 거치는 동안, 생산 균주는 높은 생산성을 가지게 되었지만 야생 균주보다 성장속도, 글루코스 소비속도 등이 저하되어 생산성을 떨어뜨리는 밝혀지지 않은 2차적인 돌연변이를 포함하게 되었다. 이러한 원하지 않는 2차적인 돌연변이를 배제한 최적의 아미노산 생산균주를 개발하기 위해 이번 연구에서는 특이 analogue를 통한 선택적 선별없이도 가능한 스크리닝 시스템을 개발하고 이를 통한 쓰레오닌과 라이신 생산균주를 얻는 방법을 개발하였다. 쓰레오닌과 라이신의 대사 경로 분석을 기반으로 하여 이들 아미노산의 과생산균주의 개발에 필요한 목적 유전자를 선별하였다. 본 연구에서 새롭게 개발된 방법으로 인위적인 돌연변이 유발과 선별한 결과, 이들 유전자중 aspC, ppc, lysC, 그리고 thrABC의 경우 아미노산의 생산에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 선별 변이된 목적 유전자를 야생균주에 도입시켜 flask 발효를 통해 확인해 본 결과, 변이된 ppc, lysC, 그리고 thrABC를 도입한 균주에서 쓰레오닌과 라이신 생산이 증가 된 것으로 나타났다. 선별 변이된 유전자의 돌연변이 부위를 선택적으로 야생균주의 genome 부위에 해당하는 부위에 선택적으로 치환시킨 결과 야생균주의 생리적 특징을 가지면서 원하는 아미노산의 생산이 증대된 것을 확인 할 수 있었다. 본 연구에서 새롭게 개발된 방법이 산업적으로 유용한 생산균주 개발에 효과적일 것으로 여겨진다.
