In order to purify plasmalogen of phospholipids from bovine heart and brain, hospholipase A1 from Serratia sp. MK1 was used. This enzyme hydrolyzes only the ester bond at sn-1 position of diacyl glycerophosphocholine, not the ether bond of plasmalogen. We, therefore, obtained higher purity of plasmalogen of phospholipids from bovine heart and brain with the phospholipase. For the selection of the suitable reaction system, the reaction was examined in a two-phase system and an emulsion system. The purity of plasmalogen in the two-phase system was found to be better than that obtained in the emulsion system. In the case of the emulsion system $CaCl_2$ was required and 60% of diacyl glycerophosphocholine was hydrolyzed. However, in the two-phase system no $CaCl_2$ was required and most of diacyl glycerophosphocholine was hydrolyzed within 45 min. It was found that Tris-Cl buffer was better than phosphate buffer for the reaction. In Among various solvents, butyl acetate showed best catalytic activity and enzyme stability. Therefore we selected butyl acetate as a solvent in a two-phase system. The different ratios of solvent-aqueous phase had no significant effects on the purity of plasmalogen. In case of ethanolamine containing substrate, diacyl glycerophosphoethanolamine was completely hydrolyzed. When crude plasmalogen containing phospholipid was used, 99% purified plasmalogen was obtained at 0.5% substrate concentration.
Synthesis of useful phospholipid with phospholipase $A_2$ was investigated. We synthesized phospholipids with PUFA (poly unsaturated fatty acid) and selected EPA (eicosapentaenoic acid) as a PUFA. For the increasing yield of PUFA-phospholipid, optimal EPA and enzyme quantity was investigated. Optimal EPA (using EPA-ester as a acyl donor) quantity was 50 mg when LPC was 10 mg. Phospholipase quantity was determined to 5 mg in considering reactant viscosity and enzyme cost. There are various parameters that govern this PUFA-phospholipid synthesis reaction and $a_w$ (water activity) was very important factor. The optimal $a_w$ should exist in most organic synthesis reaction in non-aqueous condition. Controlling the optimal $a_w$ during the synthesis reaction can increase the yield. We investigated the effect of initial $a_w$ of reactant and this showed low PUFA-phospholipid yield. Initial $a_w$ control did not maintaining the $a_w$ in the reaction vial. For the continuous $a_w$ control various salt hydrate pair was used. In case of direct addition of salt pair, the optimal $a_w$ was 0.80 and that was controlled by $Na_2B_4O_7$ (10/5) hydrate pair. Also, in case of indirect addition of salt pair, optimal $a_w$ was 0.80 and that was controlled by $Na_2B_4O_7$ (10/5) hydrate pair. PUFA-phospholipid yield was higher in solvent system than in solvent free system. Both two acyl donors (free fatty acid (EPA) and fatty acid ethyl ester (EPA-ester)), fatty acid ester form showed higher PUFA-phospholipid synthesis than in case of free fatty acid. Closed reactor system was appropriate compared to open reactor system.
소의 심장과 뇌에서 유래한 포스포리피드의 플라스마로젠을 정제하기 위하여 Serratia sp. MK1에서 생산한 포스포리파제 $A_1$을 이용하였다. 포스포리파제 $A_1$은diacyl glycerophosphocholine의 sn-1 위치의 에스터 결합을 가수분해하고 플라스마로젠의 에테르 결합을 분해하지 않기 때문에 이를 이용하여 소의 심장과 뇌에서 유래한 포스포리피드로부터 고순도의 플라스마로젠을 얻을 수 있었다. 적합한 반응 시스템을 선정하기 위하여 이상계와 에멀젼 시스템을 실험하였다. 이상계에서의 플라스마로젠의 순도가 에멀젼에서 보다 더욱 높았다. 에멀젼에서의 반응은 $CaCl_2$이 필요하였고 60%의 diacyl glycerophosphocholine이 가수분해 되었다. 그러나 이상계에서는 $CaCl_2$가 필요하지 않았고 diacyl glycerophosphocholine이 45분내에 모두 가수 분해되었고 이상계를 구성하는 완충액은 트리스-완충액이 포스페이트-완충액보다 좋았다. 여러 가지 유기용매 중에서 반응 활성과 효소의 안정성을 고려할 때 뷰틸아세테이트가 이상계의 유기용매로서 가장 좋았다. 유기용매-수용액의 비율을 달리했을 경우는 반응에 크게 영향을 미치지 않았다. 에탄올아민을 함유한 기질을 사용했을 경우에도 diacyl glycerophosphoethanolamine이 완전히 가수분해 되었다. 최적의 조건에서 99% 순도의 정제된 플라스마로젠을 얻을 수 있었다. 중성지질등이 함유된 원재료상태의 기질을 사용했을 때는 0.5% 농도에서 고순도의 플라스마로젠을 얻을 수 있었고 한 번 정제된 기질을 이용할 때보다 경제적으로 유리하였다.
포스포리파제 $A_2$를 이용하여 다가 불포화지방산 (PUFA)을 함유한 인지질을 합성하기 위하여 EPA (eicosapentaenoic acid)를 PUFA로서 사용하였다. PUFA함유 인지질의 수율을 높이기 위하여 EPA(혹은 EPA-ester)와 효소의 양을 달리 하였다. 라이소-인지질을 10mg으로 했을 때 EPA의 양은 50mg 이었고 포스포리파제의 양은 반응물의 점도 및 효소의 비용을 고려 할 때 5mg으로 정하였다. PUFA 함유 인지질의 합성에는 여러 가지 중요한 요소들이 있으나 그 중에서 수분활성($a_w$)이 가장 중요한 요소이다. 비수용성 조건에서의 합성에 있어 적합한 수분활성이 존재한다. 따라서 반응중의 수분활성을 조절하면 수율도 증가 시킬 수 있다. 반응물의 최초 수분활성도만 맞추어 줄 때는 낮은 PUFA-인지질의 수율을 보여준다. 최초 수분활성도 조절은 반응기내의 수분활성도를 지속적으로 조절하지 못한다. 연속적인 수분활성도의 조절을 위해 여러 가지의 salt hydrate pair가 사용되어졌다. 직접적인 salt pair의 첨가의 경우 최적의 수분활성도는 0.80이었고 사용된 salt는 $Na_2B_4O_7$ (10/5) 였다. 간접적인 salt pair의 첨가의 경우에도 최적의 수분활성도는 0.80이고 역시 $Na_2B_4O_7$ (10/5) 에 의해서 조절되어졌다. 유기용매보다 비유기용매 시스템에서 PUFA-인지질의 수율 (11.3%) 이 높았다. 두가지 acyl donor (자유지방산(EPA)과 지방산-에스터(EPA-ester)) 중에서는 지방산-에스터가 높은 수율을 보여주었다. 개방식 반응기보다 폐쇄식 반응기가 보다 PUFA-인지질 합성에 적합하였다.
