To enhance in vitro refolding yield of Pseudomonas fluorescens SIK W1 lipase expressed as inclusion bodies in E.coli, response surface methodology(RSM) was applied to optimize three factors such as GdnHCl concentration, protein concentration and pH simultaneously. The refolding yield could be increased to about 90 % (9000 U/mg) by this method and this was about 150 % increase compared with the traditional optimization. The optimization of refolding was executed at the various conditions by RSM. Refolding yield was increased by lowering refolding temperature from 25℃ , to 4℃ and to -15℃ but the rate of refolding was decreased by lowering temperature. The refolding yield at 4℃ was 325% higher than the yield at 25℃. The refolding yield at -15℃ was increased slightly as compared with the yield at 4℃ but much longer time was needed to complete refolding than 4℃. Interestingly, the optimum was changed by adding the refolding additives and it could be traced by RSM. Addition of 40% glycerol shifted the optimum concentration of GdnHCl from 0.7 M to 1.4 M and addition of 0.5 M Arginine shifted the optimum concentration of GdnHCl to 0.5 M. From this result the mechanism of refolding additives (glycerol and arginine) could be investigaed. In addition, fluorescence were also used to monitor the folding transition of lipase and this was compared with the restoration of the enzyme activity. There was consistency at the high range of GdnHCl concentration but disagreement at the low range.
E.coli에서 함유체 형태로 발현되는 Pseudomonas fluorescens SIK W1 리파제를 활성화하는데 있어 최종 GdnHCl 농도, 단백질 농도, pH 등 여러 가지 조건을 최적화 하기 위해 반응 표면 분석(RSM)방법을 사용하였다. 이 방법에 의해 리파제를 불활성 형태인 함유체로부터 90% (9000U/mg)정도까지 활성화 시킬 수 있었으며 이것은 전통적인 최적화 방법에 비해 150% 증가된 수치이다. 여러 다른 조건에서 최적화를 수행하였는데 리파제 재활성화 수율은 온도를 25℃ 에서 4℃ 그리고 -15℃로 감소시킴에 따라 증가하였으나 재활성화 속도가 감소하였다. 4℃에서의 재활성화 수율은 25℃에 비해 325 %나 증가하였다. -15℃에서도 재활성화 수율이 4℃에 비해 약간 증가하였지만 4℃에 비해 매우 긴 시간이 요구되었다. 재활성화를 촉진시키는 첨가제를 넣었을 때 최적 조건이 변하였다. 그때의 변화는 최적 조건을 반응 표면 분석을 통해 추적할 수 있었다. 40% Glycerol에 의해 최적 GdnHCl 농도가 0.7 M에서 1.4M로 변하였다. 또한 0.5 M Arginine에 의해 최적 GdnHCl농도가 0.7 M에서 0.5 M로 변하였다. 이러한 결과들로부터 Glycerol과 Arginine의 재활성화 첨가제로서의 작용기작을 설명할 수 있었다. 이와 함께 fluorescence (단백질의 형광)가 단백질 활성 전이를 관찰하는데 사용되었으며 이것을 리파제 활성 측정 방법과 비교하였다. 이 실험에서 높은 농도의 GdnHCl 구역에서는 두 방법의 일치가 있었지만 낮은 농도 구역에서는 일치하지 않았다.
