This study was conducted to assess the effects of chemical carcinogens on the gap junctional intercellular communication in cultured mammalian cells and to prove that gap junction channel provide a pathway for the calcium-mobilizing second messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate ($IP_3$). Clone 9 cells derived from rat liver were treated with various carcinogens and anticancer drugs. Gap junctional communication was assessed by measuring the transfer of scrape-loaded lucifer yellow dye. Direct carcinogens such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, hydroxylamine and ethidium bromide exhibited strong inhibition of intercellular communication, while indirect carcinogens such as aflatoxin $B_1$ and ethionine exerted minor effects. The passage of second messenger molecules through gap junction channels was proved by the experiment in which scrape-loaded [$^3H$]-$IP_3$ was transferred into cells along the scraped line. This spread of labled second messenger into neighboring cells was visualized by microautoradiography. To show the direct involvement of gap junction channel in the transport of second messenger, channels were formed in artificial unilamellar liposomes using connexin 32 gap junction protein immunoaffinity purified from rat liver. $[^3H]-IP_3$ was incorporated into vesicles containing open gap junction protein but the vesicles with closed channels failed to incorporate $[^3H]-IP_3$.
배양된 포유동물세포에서 화학적 발암물질이 간극연접을 매개로 한 세포간 대화에 주는 영향을 알아보고, 세포안에 있는 칼슘의 위치이동을 유발하는 이차신호물질인 이노시톨 1,4,5-트리스인산 ($IP_3$) 이 간극연접을 통해 주변세포로 이동함을 입증하고자 하였다. 간극연접을 통한 세포간 대화는, 단일세포층 표면위에 칼자국을 내서 형광염료 (lucifer yellow) 가 세포내로 들어가게 한 뒤 (scrape-dye loading technique) 일정시간 후에 형광을 띠는 세포수를 세어 수치화할 수 있다. 배양된 쥐 간세포인 clone 9 에 여러가지 발암물질과 항암물질을 처리해서 세포간 대화변화를 관찰하였다. 알킬화제이고 발암작용을 갖는 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidie (MNNG) 를 0.3 mg/ml의 농도로 처리하면, 60분 후에 형광염료의 이동이 대조세포군보다 90% 까지 감소하는 것이 관찰되었다. MNNG 외에도 hydroxylamine, ethidium bromide 같은 직접적 발암제는 세포간 대화를 강력하게 억제하는 반면, 간접적 발암제인 aflatoxin $B_1$ 이나 ethionine 등은 별다른 억제작용을 나타내지 못하였다. 간극연접을 통해서는 분자량이 큰 세포대사물질보다는 작은 신호물질이 이동할 수 있다. 간극연접에 대한 이차신호물질의 투과성은 간극연접단백질로 재구성된 리포좀을 사용한 방법과 세포층에 $[^3H]-IP_3$를 scrape loading 하는 방법을 통해 증명하였다. $[^3H]-IP_3$ 는 열린 간극연접단백질이 있는 리포좀내로는 들어가지만 닫힌 간극연접단백질이 있는 리포좀 내로는 들어가지 못하였으며, clone 9 세포군에서는 $[^3H]-IP_3$ 가 주변세포로 이동하였다. 발암물질에 노출된 후 단시간 내에 세포간 대화가 억제되면, 세포집단 내에서 신호물질을 통한 정보의 공유가 이루어지지 못하기 때문에 일부세포들이 항상성을 잃고 암세포로 전이될 가능성은 더욱 커지게 되는 것이다.