Relationship between the state of protein phosphorylation and tumor necrosis factor α(TNF) induced apoptosis was studied in HL-60 cells. Incubation of cells with TNF resulted in progressive increases in DNA fragmentation and the phosphorylation of a specific protein with 35 kDa of molecular weight. Serine residues in 35 kDa protein were specifically phosphorylated during apoptosis mediated by TNF. Calmidazolium, an inhibitor of $Ca^{2+}$/calmodulin-dependent protein kinase, inhibited the phosphorylation of 35 kDa protein as well as DNA fragmentation in cells treated with TNF. However, okadaic acid, known as a protein phosphatase inhibitor did not change the phosphorylation of 35 kDa protein but rather induced DNA fragmentation. These data provided support that phosphorylation status of 35 kDa protein is a critical requirement in the activation of programmed cell death in HL-60 cells. The involvement of phosphorylation of this specific protein in the apoptotic process was further supported by the finding that calmidazolium also suppressed the phosphorylation of 35 kDa protein and DNA fragmentation in the cells undergoing apoptosis mediated by other apoptosis inducers such as calcium ionophore, colchicine and cycloheximide. It was also showed that the increased intracellular $Ca^{2+}$ concentration is a necessary requirement of the phosphorylation of 35 kDa protein by $Ca^{2+}$/calmodulin-dependent protein kinase in TNF induced apoptosis. A $Ca^{2+}/Mg^{2+}$-dependent endonuclease which induces DNA fragemetation activated by TNF treatment and inhibited by calmodulin antagonist.
Tumor necrosis factor(TNF)에 의해 유도된 HL-60 세포의 예정사(apoptosis)와 이 과정에서 유도되는 단백질 인산화와의 관계를 조사하였다. TNF를 처리한 세포는 예정사의 특이적인 현상인 점진적인 DNA의 단편화의 유도와 35 kDa의 분자량을 가진 단백질의 인산화의 증가를 나타내었으며, 이 단백질의 여러 아미노산들 중 serine 잔기에 특이적인 인산화 현상을 보였다. $Ca^{2+}$/calmodulin 의존성 단백질 kinase의 억제제인 calmidazolium은 TNF에 의해 유도된 35 kDa 단백질의 인산화와 DNA 단편화를 억제하였다. 이와는 달리, 단백질 phosphatase의 억제제인 okadaic acid를 처리하였을 경우는 35 kDa 단백질의 인산화 억제가 일어나지 않고 오히려 DNA 단편화가 증가하는 양상을 나타내었다. 이러한 결과들은 이 35 kDa 단백질의 인산화가 HL-60 세포의 예정사의 유도에 필수적인 요소라는 것을 제시해준다. 예정사의 다른 유도제들로 알려져 있는 calcium ionophore와 colchicine, cycloheximide에 의한 HL-60 세포의 예정사에서도 TNF에 의한 예정사와 마찬가지로 35 kDa 단백질의 인산화가 증가하고, calmidazolium에 의해 DNA 단편화와 단백질 인산화가 억제되는 것으로 보아 이 특정 단백질의 인산화가 예정사를 겪는 세포들에 나타나는 공통적인 현상이라는 것을 알 수 있었다. $Ca^{2+}$/calmodulin 의존성 단백질 kinase에 의한 이 단백질의 인산화 현상은 세포내 $Ca^{2+}$ 농도의 증가에 의해서 조절되어 지는 것으로 나타났다. 또한, TNF의 처리는 DNA 단편화에 관여하는 것으로 알려진 $Ca^{2+}/Mg^{2+}$ 의존성 endonuclease의 활성을 증가시키고, calmidazolium에 의해 이 활성이 다시 억제되었다.
