A lipase gene (lipK) from Pseudomonas sp. KFCC 10818 was cloned in Escherichia coli JM83. The nucleotide sequence revealed the presence of two open reading frames of 933 and 492 nucleotides, respectively. The lipK gene was assumed to encode a lipase of311 amino acids. The gene was used GTG as initiation codon instead of ATG. The lipK gene alone was not conferred a lipase phenotype when expressed in E. coli using the tac promoter of the pKK223-3 plasmid. Downstream from lipK an extra open reading frame was identified and named limK. The limK gene could presumably encode a protein of 164 amino acids. The lipK was well expressed only in the presence of the complete limK. Some lipase genes from Pseudomonas have lipase expression-regulating gene. The protein from this gene has not been isolated or characterized yet. The predicted amino acid sequence of the lipase was shown 36-54% identity to the modulator- or activator-containing lipases of Pseudomonas species. But no protein homologous to LimK, limK gene product, was identified. A putative catalytic triad, $Ser^{108}$, $ Asp^{255}$, $His^{277}$, was determined by the comparison of the amino acid sequence of the lipase from Pseudomonads and threedimensional structure of Pseudomonas glumae. Extremely high identity was observed in the regions containing the consensus sequence of lipase, Gly-X-Ser-X-Gly. Lipase production in E. coli JM109 containing both lipK and limK gene started in the early exponential phase of cell growth. Most of the lipase activity was found in the cytoplasm. The cell extract was applied on ion exchange column, hydrophobic interaction column, and gel filtration column. The final product was 35-fold purified with a yield of 17%. The optimum pH and temperature of the lipase was pH 9.0 and 70℃ (in range of 20℃ to 70℃), respectively.
Pseudomonas sp. KFCC 10818의 lipase 유전자(lipK)를 E. coli JM83에서 cloning 하였다. lipase 유전자를 분석한 결과 2개의 open reading frame이 존재하고 있음을 발견 하였으며, 각각은 933개와 492개의 염기쌍으로 구성되어 있었다. lipK 유전자는 311개의 아미노산으로 구성된 lipase를 coding 할 수 있다. 이 유전자는 ATG 대신에 GTG를 개시 codon으로 사용하는 것으로 보아진다. lipK 유전자를 E. coli에서 pKK223-3의 tac promoter 조절하에서 발현 시켰을 때 lipK 유전자 단독으로는 lipase 활성을 나타내지 못하였다. lipK의 downstream에서 또 하나의 open reading frame을 발견 하였으며, 그 유전자를 limK라 명명 하였다. limK 유전자는 164개의 아미노산으로 구성된 단백질을 code 할 수 있다. lipK 유전자는 완전한 limK 유전자의 존재하에서만 발현 되었다. Pseudomonas의 일부 lipase 유전자는 lipase 발현을 조절하는 유전자를 가지고 있는 것으로 알려져 있으나 그 발현 산물의 특성은 아직 밝혀져 있지 않다. lipase 유전자의 염기 서열에서 유도된 아미노산 서열은 modulator 또는 activator를 포함하는 Pseudomonas의 lipase와 36-54%의 동일성을 보였다. 여러 Pseudomonas lipase의 아미노산 서열과 Pseudomonas glumae의 3차 구조를 비교함으로써 잠정적인 catalytic triad (Ser108-Asp255-His277)를 결정 하였다. 특히, lipase의 consensus sequence인 Gly-X-Ser-X-Gly을 포함하는 부위에서 높은 동일성이 관찰 되었다. lipK와 limK 유전자를 모두 포함하는 E. coli JM109에서 lipase의 합성은 세포 성장의 초기 exponential phase에서 시작 되었으며, 대부분의 lipase 활성은 cytoplasm에서 발견 되었다. 이 lipase를 ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography와 gel filtration chromatography를 통하여 17% yield로 35배 정제 하였다. 이 lipase는 pH 9.0과 70℃ (20℃에서 7℃ 까지의 측정 범위 내에서) 에서 가장 높은 활성을 나타 내었다.