This dissertation presents drug-loaded liposomal indocyanine green for enhanced combination therapy through thermosensitive release. To accomplish efficient therapeutic effect with reduced side effects, nanobiotechnology has been combined with phototherapy in several decades. Especially, photothermal therapy (PTT) is one of the most efficient therapeutic methods that can induce necrosis of a specific malignant region of tumor with reduced side effects in normal tissues. To realize medical applications of PTT in clinics, near infrared (NIR) region of light has been studied in detail to activate photothermal agent. Indocyanine green(ICG) is the effective NIR fluorescence agent that is FDA approved medical diagnostic agent. Also, ICG has been studied to apply its phototherapeutic effect to treat target disease more efficiently with ICG activation by NIR. However, its physical and chemical characteristics, like albumin binding in bloodstream, fast clearance in human body, solvent-dependent phototherapeutic effect, hinder its therapeutic application, though ICG has unique advantages compared than other phototherapeutic agents. To overcome these problems, ICG-encapsulated nanoparticles have been studied in decades. In this dissertation, liposomal ICG is developed to accomplish photothermal therapy and combination therapy between phototherapy and chemotherapy. The first main research is engineering liposomal indocyanine green (ICG) to maximize its photothermal effects while maintaining the fluorescence intensity. Second main research is enhanced therapeutic efficiency using FDA-approved PTT agent, Indocyanine green (ICG), and drug, cisplatin, and drug carrier, liposomes, by combination therapy through thermosensitive release. Finally, liposomal indocyanine green is applied to selectively treat adipocytes that include excessive lipid droplets to overcome obesity. These results are anticipated to contribute development indocyanine green-based nanoparticles to overcome current problems and to enhance therapeutic efficiency for applying in clinics.
이 연구는 효과적인 질병 치료를 위해 복합치료요법(Combination therapy)를 적용하기 위해 인도시아닌 그린을 탑재한 리포좀을 개발하는 연구이다. 바이오나노기술(Bionanotechnology)의 목표는 기존의 항암치료요법(Chemotherapy)이나 질병 이미징을 위해 사용 되는 물질들이 체내에 적용되었을 때 발생하는 문제점들을 적절한 나노물질(Nanoparticles)로 함께 전달함으로써 이를 보완하고, 그 기능을 향상시켜 새로운 응용 분야를 개척하는 데에 있다. 본 연구에서 강조하는 인도시아닌 그린(Indocyanine green, ICG)은 근적외선(Near infrared, NIR) 영역대의 광자극에 의해 활성화 되어 형광 신호를 방출하는 물질로서, 광열효과(Photothermal effect)와 광역동효과(Photodynamic effect)를 동시에 가지는 물질이다. 하지만 ICG는 수용액 내에서 상호간 응집(Self-aggregation)된 상태로 존재하기 때문에, 위의 특성들이 감소하는 물질적 특성을 가지고 있다. 이와 같은 ICG의 단점을 극복하고 인도시아닌 그린의 형광물질로서의 특성과 광치료용 물질로서의 특성을 강화하여 진단 및 치료에 응용하기 위해 다양한 나노물질에 ICG를 캡슐화(Encapsulation)하거나 접합(Conjugation)한 형태로 사용하고자 하는 노력들이 많이 이루어지고 있다.
ICG를 캡슐화 또는 접합한 형태로 사용하는 나노물질은 대표적으로 사람혈청알부민 복합체(Human serum albumin complex, HSA complex), 마이셀(Micelle) 형태와 리포좀(Liposome) 형태로 대표되는 지질 나노입자(Lipid nanoparticles), 폴리머 나노입자(Polymeric nanoparticles), 탄소나노튜브 (Carbon nanotube), 그리고 ICG-항체 접합체(ICG-Antibody conjugates) 등이 존재한다. 이 중에서도 우리는 ICG가 가지는 구조적 특성에 의해 ICG의 나노물질 내 캡슐화가 용이하고, 추가적인 약물을 함께 캡슐화할 수 있으며, 생체 내에 적용되었을 때 높은 수준의 안정성이 검증된 리포좀을 나노물질로 선택하였다. 리포좀 내에 인도시아닌 그린을 캡슐화 하는 경우, ICG가 갖는 상호간 응집 현상에 의한 형광세기 감소 및 광치료 효과 감소를 막을 수 있으며, ICG가 체내에 전달되었을 때 알부민에 부착(Adhesion)되는 성질을 방지하고 장시간 동안 리포좀 내에 캡슐화 된 상태로 혈액 내를 순환할 수 있게 된다.
Chapter 2에서 설명한 연구 주제는 ICG가 리포좀 내부에 캡슐화 되었을 때, 광열효과를 가장 극대화 할 수 있는 리포좀의 조성을 확보하고, 이를 암치료에 응용하여 극대화된 광치료효과에 의한 효과적인 항암치료를 달성하는 것이다. 소태아혈청(FBS)의 농도를 달리한 수용액에 ICG가 동일양 녹아 있을 때, 소태아혈청의 농도가 증가함에 따라 ICG에 의한 광열효과 역시 증가하는 것을 확인하였다. 소태아혈청의 농도가 증가함 에 따라 ICG의 분산도가 높아지고 상호간 응집효과가 감소함을 미루어볼 때, ICG가 효과적으로 분산되어 있을수록 ICG의 광열효과가 상승한다는 것을 알 수 있다. 핵심 지질을 DMPC를 사용하면서 총 지질과 ICG의 몰비율을 1000 : 4로 리포좀을 수화(Hydration)시켰을 때, 가장 효과적인 광열효과를 나타내는 리포좀을 합성할 수 있었다. 해당 리포좀의 향상된 광치료효과를 증명하기 위해 세포 평판배양(Plate culture), 종양 편구(Tumor spheroid)를 통한 생체 외 환경(In vitro condition)에서 암세포의 3차원 구조를 모방한 모델을 사용하였다. 또한, 생체 내 환경(In vivo condition)에서 원발암(Primary tumor)나 림프절에 전이된 전이종양(Metastatic tumor)을 효과적인 광치료를 통해 치료하는 방법에 응용해보았다.
Chapter 3에서 설명한 연구 주제는 ICG가 리포좀 내부에 캡슐화 된 구조에, 항암치료요법에 응용될 수 있는 항암치료제를 동시에 캡슐화함으로써 광치료효과와 항암치료요법이 동시에 달성되는 복합치료요법을 통해 효과적인 암치료를 달성하는 것이다. 항암치료제의 예로서 시스플라틴(Cisplatin)이 사용되었고, 리포좀 내부에 캡슐화 된 시스플라틴이 근적외선 레이저에 의해 활성화 된 ICG에 의해 발생된 광열효과에 의한 감열성적 약물방출(Thermosensitive drug release) 효과를 달성하기 위해 리포좀의 핵심 지질로서 DPPC가 사용되었다. DPPC의 전이 온도는 약 41℃로서 체온(36.5℃)보다 약간 높은 것이 특징이다. 지질은 전이 온도보다 낮은 온도에서는 겔 상(Gel phase)으로, 지질 간에 조밀한 간격을 유지하여 리포좀의 안정적인 인지질 이중층이 유지될 수 있다. 하지만, 전이 온도보다 높은 상태에서는 액체상(Liquid phase)으로 전이됨으로써 리포좀의 인지질 이중층의 불안정성이 높아짐에 따라 리포좀 내부에 캡슐화된 약물이 리포좀 외부로 방출된다. 따라서, 근적외선 레이저에 의해 ICG가 활성화 되어 발생한 광열효과와 광열효과에 의한 리포좀의 구조적 불안정성으로 야기된 리포좀 외부로의 약물 방출에 의한 항암치료효과가 함께 적용되어, 근적외선 레이저가 조사된 선택적인 영역에서 복합치료요법에 의한 암치료 효과가 극대화 될 수 있다. 또한, 리포좀의 구조적 특성에 의해 암치료제에 의한 다른 조직에서 야기될 수 있는 부작용이 감소되는 효과가 있다. 언급한 나노물질의 암치료 효과를 검증하기 위해 생체 외 환경과 생체 내 환경에서 향상된 암치료효과를 증명하였다.
Chapter 4에서 설명한 연구주제는 Chapter 3에서 사용한 나노입자를 암치료가 아닌 비만치료를 위한 지방세포의 선택적 사멸을 위해 암치료제를 대체하여 Sodium deoxycholate를 캡슐화한 나노물질을 응용한 것이다. Sodium deoxycholate와 인지질을 혼합한 복합체를 지방세포 사멸을 위해 사용된 선행 연구들이 존재한다. 본 연구를 통해 Sodium deoxycholate와 지질을 혼합한 리포좀에 ICG를 함께 캡슐화하여, ICG의 광치료효과와 Sodium deoxycholate의 세포사멸효과가 동시에 적용되도록 하여 효과적인 지방세포 사멸을 유도하였다. 리포좀 구조 내부에 캡슐화된 Sodium deoxycholate를 정량화하기 위해 NMR 분석 기법을 사용하였다. 생체 외 환경에서 지방세포를 모방하기 위해 3T3-L1 세포를 평판 배양하였고, M1 배지를 이용해 3T3-L1 세포를 지방세포로 분화하였다. M1 배지를 처리한 시점으로부터 12일 가량이 지났을 때 분화된 지방세포 내의 지방량이 최대화되는 것을 Oil red O 염색법을 통해 증명하였다. 언급한 나노물질의 지방세포 사멸효과를 검증하기 위해 생체 외 환경에서 리포좀 처리 후 근적외선 레이저를 조사하였다. 그 결과, Sodium deoxycholate가 포함된 인도시아닌 그린 리포좀이 비교적 향상된 지방세포 사멸효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 생체 내 환경에서도 해당 나노물질은 뛰어난 지방조직 분해효과를 나타내는 것을 확인하였다.
세가지 Chapter에서 설명한 연구주제들을 통해 인도시아닌 그린 리포좀이 가지는 광치료용 나노물질로서의 우수성에 대해 증명하였고, 약물과 함께 캡슐화된 인도시아닌 그린 리포좀은 복합치료요법을 통해 보다 향상된 치료효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 인도시아닌 그린 리포좀이 암치료에 적용될 수 있는 것은 물론이고, 적절한 약물을 함께 캡슐화 했을 때 지방세포 선택적 사멸을 통해 비만개선에 응용될 수 있음을 함께 증명하였다. 이후 추가적인 연구를 통해 적합한 약물이 함께 캡슐화된 인도시아닌 그린 리포좀이 다양한 질병의 치료에 응용될 수 있다는 것을 확인한 예가 되겠다. 향후 관련 연구가 지속적으로 수행되어서 해당 나노물질의 우수성이 널리 검증되고, 치료효과를 더욱 향상시킬 수 있는 추가 연구가 이루어지는 데 시금석이 될 수 있기를 희망한다.