During pursuit of PhD degree, I accomplished development of novel tools and strategies for the production of various important natural compounds. As malonyl-CoA is an important intermediate for the production of various natural products including polyketides and phenylpropanoids, to accurately and easily measure precursor availability, malonyl-CoA biosensor using a polyketide synthase was developed. The biosensor is based on a type III polyketide synthase (PKS) RppA, enabling colorimetric screening. Using this biosensor, four representative natural compounds (two polyketides and two phenylpropanoids) could be overproduced. Having developed a biosensor that can screen target compound overproducers, development of an efficient tool for rapid and multiplex regulation of target gene expression was also needed. Therefore, a synthetic sRNA platform was developed to enable compatible and simultaneous knockdown of target genes in already engineered E. coli strains. An E. coli genome-scale sRNA library was constructed using this expanded sRNA expression platform, and was applied for enhanced production of two natural colorants. Next, integrated strategies encompassing systems metabolic engineering, membrane engineering, and vesicle engineering were developed to further augment the production of hydrophobic natural products, taking violacein derivatives as proof-of-concept examples. Aromatic polyketides can be produced from both type III and type II PKS systems; the type III PKS AaOKS used for construction of malonyl-CoA biosensor mentioned above and type II PKS from Photorhabdus can produce the same aromatic polyketide shunt product. Especially, employing type II PKS in heterologous model microorganisms (e.g., E. coli) – which is a relatively overlooked category of PKSs – was sought to produce valuable aromatic polyketides used as food additives, cosmetics, drugs, etc. Applying this strategy along with biochemical reaction analyses and in silico-assisted enzyme mutagenesis allowed successful production of carminic acid, which is a widely used red food colorant. Engineered E. coli strains were also developed which are capable of producing decaketides resistomycin (antibiotic) and $\varepsilon$-rhodomycinone (an aglycone of doxorubicin, an anticancer agent) for the first time. Silybin precursors (coniferyl-alcohol and dihydroxyquercetin) were successfully produced in E. coli, and the novel biosynthetic pathways towards $\beta$-lapachone analogues were also constructed.
박사학위 취득을 위한 연구 기간 동안 다양한 천연물의 생산을 위한 새로운 시스템대사공학 도구 및 전략을 개발하였다. 말로닐-코에이는 폴리케타이드 및 페닐프로파노이드를 포함한 다양한 천연물의 생산에 있어 중요한 공통된 전구체이다. 세포 내 말로닐-코에이 농도를 정확하고 쉽게 측정하는 것은 중요하므로, 이를 위하여 폴리케타이드 생합성 효소(PKS)를 이용한 새로운 말로닐-코에이 바이오센서를 개발하였다. 해당 바이오센서는 타입 III PKS인 RppA를 이용하여 개발되어, 색깔 스크리닝이 가능하다. RppA 바이오센서를 활용하여 네 가지 중요 천연물(두 종류의 폴리케타이드 및 두 종류의 페닐프로파노이드)의 과생산에 성공하였다. 이와 같이 표적 물질을 과량으로 생산하는 미생물 균주를 스크리닝할 수 있는 바이오센서가 개발되었으므로, 미생물 내의 유전자의 발현량을 빠르고 복합적으로 조절할 수 있는 효율적인 대사공학적 도구의 개발이 필요하였다. 이에 따라 동시다중 표적 유전자 발현 억제를 위한 신규 합성 조절 sRNA 플랫폼을 개발하였다. 이렇게 구축된 확장된 sRNA 플랫폼 상에 미리 구축된 유전체 수준 sRNA 라이브러리를 이전한 후, 이를 두 종류의 천연물의 과량 생산에 적용하였다. 나아가, 비수용성 천연물의 생산능을 더욱 증가시키고자 세포막 엔지니어링 및 세포 소낭 엔지니어링 등을 융합한 융합 기술을 개발하였고, 이를 이용하여 비올라세인 계(系) 물질들의 과량 생산에 성공하였다. 방향족 폴리케타이드는 타입 II 또는 타입 III PKS로부터 생산될 수 있는데, 특히 말로닐-코에이 바이오센서 구축을 통하여 테스트되었던 타입 III AaOKS와 Photorhabdus 유래 타입 II PKS 시스템은 동일한 폴리케타이드를 생산할 수 있다. 특히 타입 II PKS는 그동안 상대적으로 대장균과 같은 외래 미생물에의 적용이 다소 간과되어온 분야인데, 해당 학위 논문에서는 이를 엔지니어링하여 다양한 식품첨가제, 화장품 및 의약품에 활용되는 방향족 폴리케타이드를 고효율로 생산하고자 하였다. 이에 따라 생화학적 반응 분석 및 컴퓨터 시뮬레이션 기반 효소 엔지니어링을 적용하여 대표적 식품 첨가제인 carminic acid의 생산에 성공하였다. 또한, 대표적인 decaketide인 resistomycin (항생제) 및 $\varepsilon$-rhodomycinone (항암제인 doxorubicin의 aglycone)의 생산에 세계 최초로 성공하였다. 실리빈 전구체 두 가지 물질 (coniferyl-alcohol, dihydroquercetin) 및 베타-라파촌 유사체들 또한 성공적으로 생산되었다.
