Bioconversion of sustainable substrates into value-added compounds has received much attention to replace petrochemical process. Of the bioconversion platforms, acetogens contains the Wood-Ljungdahl pathway (WLP) that condensate carbon monoxide (CO) and carbon dioxide ($CO_2$) into acetyl-CoA, one of important central metabolites. The acetogenic metabolism via the WLP was reported to be energetically the most efficient pathway, compared to the other six natural $CO_2$ fixation pathways without losing ATP molecules under the autotrophic growth condition. Recently, to systemically understand the advantages, studies on the genome and transcription of acetogens at the genome wide level have been actively pursed. Despite the obtained systematic understandings via omics studies, developing acetogens to industrial strains requires genetic modification tools, which severely limited. In this study, omics data sets composed of genome sequencing, RNA sequencing, ribosome profiling, and differential RNA sequencing were utilized to construct synthetic biology tools for Eubacterium limosum ATCC8486. For the construction of the tools, one hundred different bioparts were developed by using 18 promoters and 18 5' UTRs that obtained from the genome, then the DNA delivery efficiency was increased by investigating optimal cell density, field strength, cell wall-weakening agents, and cell membrane-disturbing agents. Through the investigation, the efficiency increased by 3,247-folds higher from $7.7 \times 10^1$ to $2.5 \times 10^5$ colony-forming $unit/\mu g$ of DNA/optical density at 600 nm. Using the optimized approach, the synthesized bioparts were introduced and expression levels of the bioparts were characterized using enhanced green fluorescent protein. The characterized bioparts were integrated to acetolactate synthase and acetolactate decarboxylase, which responsible for synthesizing acetoin, resulting production of 1.36 mM acetoin under autotrophic growth condition in the airlift bioreactor.
생물전환은 지속 가능한 바이오매스를 고부가가치의 화합물로 전환함으로써 석유화학공정을 대체하기 위한 수단으로 많은 관심을 받고 있다. 다양한 생물전환 플랫폼 중 하나인 아세토젠은 일산화탄소 또는 이산화탄소를 중요한 중심 대사 물질 중 하나인 acetyl-CoA로 전환할 수 있는 Wood-Ljungdahl pathway (WLP)를 소유한다. 자가 영양 성장 조건에서 WLP를 통한 아세트산 생산 대사는 ATP의 손해가 발생하지 않기 때문에 자연계의 6가지 이산화탄소 고정 경로 중 에너지적으로 가장 효율적인 경로로 알려져 있다. 최근, 아세토젠에서 이 경로를 체계적으로 이해하기 위해 유전체와 전사체에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 다양한 오믹스 연구에도 불구하고, 아세토젠을 산업 균주로 개발하는 데 있어 사용 가능한 유전자 편집 기술이 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 아세토젠 중 하나인 Eubacterium limosum ATCC8486의 유전체, 전사체, 1차 전사체 및 번역체에 대한 오믹스 정보를 활용하여 합성 생물학 도구를 구축하였다. 유전체로부터 18개의 프로모터와 18개의 5' 비번역 부위를 발굴하여 최종적으로 100개의 바이오파트를 합성하였다. 또한, 바이오파트를 균주 내로 도입하고자 천기 천공법을 이용한 형질전환 방법을 최적화였다. E. limosum에 적합한 세포 농도와 전기 세기를 결정하고, 글라이신, 트레오닌, 트윈 80, 에탄올, 제한효소 억제제를 이용하여 형질전환 효율을 증가시켰다. 기존 대비 약 3200배 증가한 $2.5 \times 10^5$ colony-forming $unit/\mu g$ of DNA/optical density at 600 nm의 형질전환 효율을 얻었다. 이 형질전환 방법을 통해 바이오파트를 균주 내로 도입하고 녹색형광단백질을 이용하여 각 바이오파트의 발현 수준을 정량하였다. 이 바이오파트 라이브러리를 acetolactate synthase와 acetolactate decarboxylase에 적용하여 이산화탄소로부터 아세토인을 생산하기 위한 E. limosum을 구축하였고, 최종적으로 자가 영양 성장 조건에서 1.36 mM의 아세토인을 생산하였다.
