Enzyme-free target-catalyzed signal amplification which can overcome the limitations of the existing technologies has been recently attracting attention with the goal of rapid and early diagnosis of disease-derived target nucleic acid. In particular, studies have been reported applying this to the amplification of a quantum dot (QD)-based FRET signal. However, most of these are toxic cadmium QDs, which have a significant limitation that they cannot be applied to clinical diagnosis. In this study, the multivalent, non-toxic FRET donor was prepared using a streptavidin-biotin coupling, and the hydrogel network was formed by applying an enzyme-free target-catalyzed DNA nanostructure amplification method. It showed 3 nM of limit of detection (LOD) for miR-133A-1, a biomarker of acute coronary syndrome. In addition, to solve the false positive problem, which is essential for highly sensitive detection, the blocker DNA strategy using DNA base complementary binding and the strategy of removing overhang of amplified DNA nanostructure were used. As a result, the FRET signal that can be distinguished from a target negative sample was obtained. This is a proof-of-concept study using non-toxic FRET donor for miRNA detection based on enzyme-free amplification of DNA nanostructure. The approaches discussed in this study are expected to help develop a non-toxic target nucleic acid detection system that replaces cadmium QD.
질병 유래 표적 핵산의 신속, 조기진단을 목표로 기존 기술의 한계를 극복할 수 있는 무효소 DNA 나노구조체 증폭법이 최근 주목받고 있다. 특히 QD를 기반으로 한 FRET 신호의 증폭에 이를 적용한 연구들이 보고되었다. 그러나 이들 대부분 독성을 갖는 cadmium QD라는 점에서 실제 임상진단으로 응용할 수 없다는 중대한 한계를 가지고 있다. 본 연구에서는 streptavidin-biotin coupling chemistry를 이용해 다가 (multivalent)의 비독성 FRET 주개를 제조하고 이에 무효소 DNA 나노구조체 증폭법을 적용하여 하이드로겔 네트워크를 형성하였다. 이는 급성관상동맥증후군 (acute coronary syndrome)의 바이오마커인 miR-133A-1에 대한 3 nM의 검출한계를 보였다. 또한 고민감도 검출에 필수적인 위양성 (false positive) 문제를 해결하기 위해 DNA 염기 상보결합을 이용한 blocker DNA 전략과 증폭된 DNA 나노구조체의 돌출부 (overhang)을 제거하는 전략을 사용하였다. 그 결과, 표적 음성 샘플 대비 구분 가능한 FRET 신호를 얻었다. 본 연구는 무효소 DNA 나노구조체 증폭법 기반 miRNA 검출에 비독성 형광체를 사용한 개념 증명 (proof-of-concept) 연구이다. 본 연구에서 논의된 접근법은 이후 cadmium QD를 대체하는 비독성 표적 핵산 검출 시스템 개발에 도움을 줄 것으로 기대된다.
