Cinnamaldehyde derived from cinnamon bark has received big attention as a potent nematicide due to its high nematicidal activity. Previously in Master’s thesis, I succeeded in developing Escherichia coli (YHP05 strain) able to synthesize cinnamaldehyde. However, production titer (75 mg/L) was not enough high for commercialization, and it is desired to further engineer host for enhanced production of cinnamaldehyde. First, I engineered two amino acids-auxotrophic YHP05 strain to prototrophic strain for the economic process of cinnamaldehyde production. Next, for the efficient conversion of trans-cinnamic acid to cinnamaldehyde, I constructed a single-step conversion system by introducing co-expression system of carboxylic acid reductase (CAR) and phosphopantetheinyl transferase (PPTase) genes. In addition, to prevent the spontaneous conversion of cinnamaldehyde to cinnamyl alcohol, total 10 endogenous reductases and dehydrogenases genes were deleted. Fourth, after comparison of promoters and integration positions, cinnamaldehyde production system was integrated into optimal positions of E. coli chromosomal DNA for development of antibiotic-free, inducer-free system. Fifth, reinforcement of cofactor generation was performed for enhanced production of cinnamaldehyde. Next, to reduce the inhibitory effect of cinnamaldehyde and improve the production titer, in situ product removal (ISPR) strategy was applied in cultivations. However, cell growth retardation was occurred by acetate accumulation. To solve this problem, acetate production pathway was deleted by newly constructed CRISPR/Cas9-based scarless genome editing system. Additionally, to decrease cell toxicity to cinnamaldehyde, cell recycle system with a polymer resin and promoter replacement of efflux pumps (TolC and AcrAB) were tested. Through these metabolic engineering and process optimization strategies, I successfully demonstrated the gram-scale production of cinnamaldehyde. I also confirmed that cinnamaldehyde produced by our engineered E. coli had a nematicidal activity similar to the activity of authentic cinnamaldehyde by nematicidal assays against Bursaphelenchus xylophilus.
계피 나무로부터 유래한 신남알데하이드의 높은 선충 퇴치 활성으로 인해 잠재력이 높은 생물 농약으로써 각광받고 있다. 지난 석사 과정 연구에서, 신남알데하이드를 합성할 수 있는 대장균주를 개발하였다. 하지만 상업화를 하기에는 생산성이 낮기에, 생산성 향상을 위한 추가 균주 개량이 요구된다. 본 연구에서는 우선 신남알데하이드의 경제적 생산을 위한 플랫폼을 구축하기 위해 두 개의 아미노산 요구주를 개량하였다. 이후 효율적인 신남산의 전환을 위해, 새로운 효소 조합의 도입을 통해 단일 단계 효소 반응 시스템을 구축하였다. 또한 신남알코올로의 전환을 억제하기 위해 부산물 생성 경로를 제거하였으며, 이렇게 구축된 신남알데하이드 생산 경로를 대장균의 유전자 내부에 삽입함으로써, 항생제와 유도제를 사용하지 않는 균주를 개발하였다. 다음으로는 신남알데하이드의 생산성 향상을 위해 보조 인자 형성 반응을 강화하는 균주 개량을 진행하였으며, 세포 성장 저해를 막기 위해 아세트산 생성 경로 제거를 진행하였다. 마지막으로 신남알데하이드의 세포 독성을 완화하기 위한 전략으로 고분자 레진을 이용한 세포 순환 시스템과 유출 펌프 강화 전략을 도입하였다. 이로써 최종적으로 세계 최고 생산성을 확보할 수 있었으며, 이렇게 생합성한 신남알데하이드를 이용하여 실제 선충 퇴치 활성을 확인하였다.