Advances in molecular biology techniques, absorbing the realm of biochemistry and genetics, have dramatically improved the understanding of the molecular mechanisms of human diseases. The development of innovative strategies for target-specific treatment and diagnostics has also followed, utilizing various nano- and micro-particles with unique properties that target the disease biomarkers. Herein, I present platform technologies using nano- and micro-scale polymer conjugates for the editing of target genes as a therapeutic, as well as the detection of pathogen biomarkers for rapid diagnostics. This paper is organized as follows.
The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and its CRISPR-associated proteins (Cas9) have recently been well established as a versatile gene-editing tool, which offers a significant advantage in target-specific gene editing due to simplicity in design and procedures. Even though viral delivery has been the most widely utilized due to the benefits of high transfection efficiency, it has many limitations for applications in the clinic. In chapter 2, I introduce a non-viral delivery method based on a polymer derivatized CRISPR-complex (Cr-Nanocomplex), using sgRNA targeting antibiotic resistance. Recombinant Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9) was directly conjugated by a covalent bond with a branched polyethyleneimine, a cationic polymer, as a carrier for packaging and transferring sgRNA to bacteria, showing maintenance of Cas9 endonuclease activity after the chemical modification of protein. I hypothesized that the covalent incorporation of a minimal amount of carrier material into each molecule of Cas9 would enable efficient delivery to bacteria, which provides advantages over the conventional non-covalent lipid-based formulations. The Cr-Nanocomplex targeting mecA – the target gene involved in methicillin resistance – could be successfully delivered into Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), which have been known hard to transfect due to the thick bacterial cell wall. I also demonstrated that the delivered Cr-Nanocomplex can suppress the growth of MRSA by enhanced efficiency in editing of the bacterial genome, resulting in target-specific killing of the multidrug-resistant bacteria.
The Cr-Nanocomplex was further applied by incorporation of donor DNA for the intracellular delivery and precise gene editing in mammalian cells in Chapter 3. To evaluate the gene-editing efficiency, monoclonal cell lines of a fluorescent reporter system were used, and the Cr-Nanocomplex was applied to induce precise gene-editing including homology-directed repair (HDR) as well as non-homologous end joining (NHEJ). The delivery of the Cr-Nanocomplex into various mammalian cells resulted in greatly increased intranuclear uptake of both Cas9 and sgRNA, compared to the native complex. I also demonstrated the feasibility of the Cr-Nanocomplex on its efficacy in precise gene-editing. According to these results, the Cr-Nanocomplex can be potentially used in vivo and is expected to show efficient intracellular delivery and gene-editing efficacy, while minimizing toxicity problems.
For immediate and proper treatment of a disease, a rapid and simple assay that allows target-specific detection is essential. In Chapter 4, I proposed a facile molecular diagnostic platform suitable for point-of-care testing (POCT) using the coffee ring effect for detecting antibiotic resistance in bacteria. The assay solution including polymeric microbead-probe conjugates and isothermally amplified nucleic acid targets is applied on a tensile surface, and the spatial pattern is observed. The presence of the nucleic acid target resulted in suppression of the coffee ring effect.
In this thesis, I developed the Cr-Nanocomplex and applied the system to induce efficient gene editing in both prokaryotes and eukaryotes. I also developed a diagnostic platform that allows point-of-care testing and can be utilized for treatment decision making and monitoring treatment efficacy. Intuitive diagnostic methods have been proposed, and practical applicability has been demonstrated for a specific target. These studies have allowed me to obtain a broad and in-depth understanding of specific gene targets related to human diseases, and the ability to apply different biotechnology approaches to target the genes for medical translation.
생화학과 유전학의 영역을 흡수한 분자생물학의 눈부신 기술발전은 분자 수준에서의 수 많은 질병의 생물학적 이해를 급격하게 향상시켜왔으며, 임상 연구의 맥락에서 혁신적인 나노 및 마이크로 입자의 다양한 특성을 활용한 타깃의 분자적 표식은 질병의 진단 및 치료와 관련하여 관심이 매우 높아지고 있다. 이에, 본 학위 논문에서는 표적 치료 및 표적 진단 테스트 개발을 위하여, 나노 및 마이크로 스케일의 폴리머 접합체 시스템을 이용하여, 바이오마커인 표적 유전자의 교정 및 검출을 위한 플랫폼을 제시하였다.
최근 크게 이슈되고 있는 슈퍼박테리아의 확산을 방지하기 위해서는 병원균의 종류에 따른 표적 특이적 치료가 요구되며, 최근 혁신적인 유전자 편집 도구로 알려진, CRISPR-Cas9 시스템은 용이한 설계 및 제작으로 표적 특이적 유전자 편집에 큰 활용적 이점을 제공한다. CRISPR 시스템의 적용에 있어 현재까지는 높은 발현 효율의 이점으로 인한 바이러스성 편집이 가장 널리 이용되고 있지만, 이는 임상적 적용에 있어 많은 제한점을 가진다. 이에 chapter 2에서는 박테리아의 항생제저항성 유전자를 표적하여, 바이러스성 유전자 편집방법의 위험성이나 비바이러스성 지질 기반 물질 제형의 독성문제에 따른 실질적 편집효율을 극복하기 위하여 폴리머 접합체 기반의 비바이러스성 유전자 편집방법을 제안하였다. 폴리머 접합된 Cas9 편집체를 이용하여, 비바이러스성의 항생제 저항성 유전자 특이적 유전자 편집체 물질인 CRISPR 효소 단백질을 직접적인 공유결합을 통해 고분자 캐리어 물질로 접합하고, 이를 항생제 저항성을 표적하는 sgRNA와 혼합, 제조하여 세포내 전달 효율을 향상시키고자 하였고, 이를 CRISPR 나노복합체 (= Cr-Nanocomplex)로 명명하였다. CRISPR 나노복합체는 기존의 리포펙타민 등의 지질 기반 캐리어 물질과 비교하여 세포 내 전달 효율이 우수하였으며, 이에 따라 다제내성 박테리아를 표적으로 하는 특이적 살상을 유도함으로써, 표적유전자의 편집 효과도 우수하게 나타내었다.
이를 이어 Chapter 3 에서는 포유동물세포내에서의 CRISPR 나노복합체의 세포 내 전달에 활용하고자 설계하여, 전달에 따른 정교한 유전자 편집 효능을 확인하였다. 유전자 편집 효율을 확인하기 위하며, 형광단백질을 발현을 단일클론세포주를 형성하여 이를 통해, 비상동말단연결 (Non-homologous end joining, NHEJ) 뿐만 아니라, donor DNA를 이용한 상동재조합(Homology directed repair, HDR)을 통해 정교한 유전자의 교정으로 인한 형광단백질의 발현 변화를 유도 하여, 기존 형성한 CRISPR 나노복합체의 활용 가능성을 확대하고자 하였다. 이를 위하여 다양한 포유동물세포내에 전달을 진행하여 Cas9엔도뉴클리아제 및 타겟 표적을 위한 sgRNA 복합체 뿐만 아니라 교정유전자의 핵내 공동 전달로 인한 정교한 편집 교정의 효율이 높아진 것을 확인하였다. 외부의 물리적인 자극 없이 세포내 전달이 가능하고, 세포 내 표적유전자에 대해 비바이러스성 경로에 의한 유전자편집에 유용하게 활용할 수 있다. 결과적으로 상기 CRISPR 나노복합체를 생체 투여 제형에 이용할 경우, 높은 세포내 전달 및 유전자 편집 효율을 보이고, 비특이적 편집, 유전자변이, 세포 및 생체 독성 유발 등의 문제를 최소화할 수 있을 것으로 기대된다.
질병의 효율적인 치료를 위해서는, 즉각적이면서 경제적이고 타겟 특이적인 검출이 중요하다. 이에, chapter 4에서는 박테리아의 항생제 내성 감지를 위해 박테리아의 특정 유전자 서열을 인식하는 핵산 프로브를 마이크로 비드에 접합하여, Point-of-care testing (POCT)형 분자진단 플랫폼에 적합한 시스템을 제안하였다. 우리는 제안된 시스템의 확인을 위해, 타겟 유전자의 존재 하에 연결된 DNA tempalate와 상보적 시퀀스를 가지는 등온핵산 증폭산물과 핵산프로브 마이크로비드를 포함하는 혼합물을 비 친수성 표면에 떨어뜨려 물방울을 형성시키고 증발시켜 보았다. 수 분내에 타겟의 존재 여부에 따른 커피링 효과의 억제 패턴을 관찰할 수 있었고, 이를 통하여 우리는 직관적이고 간단하면서도 경제적인 진단 감지 시스템을 구현하고 증명해 보았다.
본 연구를 통해, 우리는 원핵 생물과 진핵 생물에서, 효율적인 유전자 편집을 유도하는 CRISPR 나노복합체의 다목적 적용을 확대하였고, 뿐만 아니라, 유전자 진단 표적의 치료적 접근을 용이하게 하기 위하여 검출지점에서 바로 이용 가능한 직관적인 진단 방법을 제안하고 시스템 설계적 접근만이 아닌 실질적인 적용 가능성을 입증 하였다. 이러한 연구들로 우리는 특히 생체 의학 접근법에 관한 광범위한 응용에서 선택적인 유전자 바이오 표적의 중요성을 폭넓게 이해 할 수 있었으며 이는 다양한 응용가능성을 입증시켜 주었다.
