Pathogenic bacteria have various survival strategies to incapacitate or evade the host’s immune responses. One of the potent strategies is to secrete diverse effectors. Vibrio vulnificus, causing gastroenteritis, primary septicemia, and necrotizing fasciitis in humans, secretes a broad range of toxins as well. Among them, multifunctional autoprocessing repeats-in-toxin (MARTX) toxins are known to be the most potent virulence factor. They consist of several effector domains and a cysteine protease domain (CPD) responsible for releasing effector domains into the cytosol of the host cells. Among the released effector domains, Ras/Rap1-specific endopeptidase (RRSP) of MARTX toxins secreted from sepsis causing the pathogen, V. vulnificus strain CMCP6 catalyzes the sequence-specific cleavage of the switch I region of Ras and Rap1, which is crucial for activation of the innate immune response during infections. To understand the recognition and cleavage mechanism of Vibrio vulnificus RRSP ($V_V RRSP$) against the Ras and Rap1, first we determined the structure of VvRRSP. The $V_V RRSP$ structure consists of an N-terminal domain (N lobe) involved in membrane localization, a C-terminal domain (C lobe) belonging to TIKI superfamily proteins, and a long loop connecting the two lobes. Through structure-based biochemical assays and cellular analysis we determined that 2His/2Glu catalytic residues are conserved across the TIKI superfamily enzyme. In addition, through a protease inhibitor screening assay, we identified that $V_V RRSP$ is a metal-independent TIKI family endopeptidase. Moreover, based on the results of in vitro KRas cleavage assays, we found that the N lobe of $V_V RRSP$ is important for enzymatic activity. Additionally, through endogenous Ras cleavage assays and confocal microscopy analysis, we showed that the N lobe not only functions in membrane localization by the $\alpha1$ -helix but also supports cleavage of the cellular substrates by inducing functional conformation of the C lobe. $V_V RRSP$ is thus a potent virulence factor that disrupts the signaling network by cleaving the Ras and Rap1 as a metal-independent TIKI family protease.
비브리오 패혈증균 (Vibio vulnificus)은 운동성이 있는 그람 음성간균으로, 치명적인 감염을 일으킬 수 있는 다양한 독소들을 분비한다. 오염된 조개류 및 어패류를 섭취하거나 피부 상처가 이 균에 오염된 바닷물에 노출되어 감염되면, 위장염, 창상 감염 (wound infection) 패혈증 및 괴사성 근막염을 유발하는 것으로 알려져 있다. 비브리오 패혈증균이 분비하는 가장 강력한 독소는 multifunctional autoprocessing repeats-in-toxin (MARTX)로, 다양하고 독립적으로 기능하는 여러 독성 인자들 (effector domains)로 이루어져 있다. 비브리오 패혈증균에 의해 분비된 MARTX 독소는 숙주세포내로 여러 독성 인자들을 동시에 방출 시킴으로써, 숙주의 면역 반응을 무력화 시키거나 회피하여 병원성을 나타낸다. 따라서 각각의 독성 인자에 대한 병인기전연구를 통해, 높은 병원성을 보이는 MARTX 독소의 온전한 세포내의 병원성 기능을 이해할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 다양한 종류의 독성 인자 중에서, 숙주의 선천 면역 활성에 중요하게 기능을 하는 Ras와 Rap1의 가수분해 활성을 가진 독성 인자에 대한 생화학적 연구를 수행하였다. Ras/Rap1-specific endopeptidase (RRSP)라 명명된, 이 독소 인자는 비브리오 패혈증균 CMCP6 균주에서 분비되는 MARTX ($V_V MARTX$) 독소의 한 독성 인자로써, Ras/Rap1의 switch I region을 서열 특이적으로 절단하는 것으로 보고되었다. 그러나 $V_V RRSP$가 Ras와 Rap1을 어떻게 인식하고 절단하는지에 대한 작용 메커니즘에 대한 연구는 미비했다. 그래서, $V_V RRSP$에 의한 기질 인식 및 작용 메커니즘을 분자수준에서 이해하기 위해, $V_V RRSP$의 구조를 결정하였다. 구조 분석을 통해, $V_V RRSP$는 숙주세포의 세포막으로의 이동에 관여하는 N 도메인과 TIKI 슈퍼 패밀리에 속하는 C 도메인으로 구성되어 있으며, 이 2개의 도메인이 긴 루프에 의해 연결되어 있음을 알 수 있었다. 구조적 정보를 바탕으로 한 생화학 및 세포 이미지 분석을 통해, $V_V RRSP$가 TIKI 슈퍼 패밀리 효소들에서 잘 보존된 2His/2Glu 활성 잔기를 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 단백질 분해 효소 억제제 스크리닝 분석을 통해, $V_V RRSP$P는 금속-비 의존적 TIKI 패밀리 단백질 분해 효소임을 확인하였다. 마지막으로, Ras 분해 분석 및 공 초점 현미경 분석을 통해, N 도메인의 $\alpha1$나선에 의해 숙주세포의 세포막에 위치할 수 있으며, C 도메인의 활성 형태를 유도함으로써 효율적으로 기질을 절단할 수 있게 하는 역할을 하는 것을 확인하였다. 일련의 연구결과는 Ras/Rap1을 분해하여 숙주의 선천 면역 활성을 저해하는 $_V RRSP$의 기질 인식 및 작용 메커니즘의 관한 이해를 제공한다
