Since its first discovery of RNA interference (RNAi), the technology has been widely applied for the genetic engineering of various organisms. Application nowadays of RNAi requires extensive amount of double-stranded RNA (dsRNA) as the inducer of gene silencing, thus the method for massive production of dsRNA should be established. In this thesis, a novel in situ synthesis of dsRNA was suggested for the increased titer. For this, T7 RNA polymerase was employed for the synthesis of final product from the production host, Escherichia coli BL21(DE3), and lytic proteins originated from bacteriophages was introduced for the leakage of this protein. RNAse inhibitor was also introduced for the stability of end product, and every engineering was done in host genome. By fed-batch fermentation of this strain, the titer of dsRNA from culture sample was obtained as 207 mg/L culture, which shows higher production rate than previous reports.
RNA 간섭은 발견 이래로 다양한 생물체의 유전공학에 이용되어 왔다. 현재 연구된 RNA 간섭의 응용 방법은 많은 양의 이중가닥 RNA의 사용을 필요로 하는데, 때문에 이들의 대량 합성은 폭넓은 응용에 있어 중요한 요소이다. 본 논문에서는 다량의 이중가닥 RNA 합성을 위하여 기존에 제시된 방법과 상이한 세포 외 합성 방법을 제시하였다. 이를 위하여 대장균 생산 균주에 여러 유전적 조작을 가했는데, 먼저 이중가닥 RNA 생산을 위한 T7 RNA 중합효소를 세포 내에서 유도적 발현시키고, 이를 세포 외로 유출시키기 위하여 박테리오파지 유래 유전자를 도입하였다. 파지 유래 용균성 단백질들은 유도 발현을 통하여 세포벽에 구멍을 내고 파괴하는 등의 기능을 통하여 세포 내 구성분을 세포 외로 노출시키도록 하며, 추가적으로 RNA의 안정성을 위하여 RNA 분해 효소 억제제 유전자를 생산 균주에 도입하였다. 본 생산 균주를 이용하여 유가적 발효를 진행하였을 때, 배양액 표본을 이용하여 약 207 mg/L 의 이중가닥 RNA 생산 역가를 얻어낼 수 있었고, 이는 기존 이중가닥 RNA의 생산 효율을 뛰어넘는 것으로 확인되었다.