Hematopoietic stem cells (HSCs) in bone marrow are pluripotent cells that are capable to constitute the hematopoiesis system through self-renewal and differentiation into immune cells and red blood cells. To keep the hematopoiesis for a life time, the maintenance of HSCs is tightly regulated. Autophagy is a self-degradation pathway for cell homeostasis and Atg5 is essential molecule for autophagy. However, the role of Atg5 in hematopoietic stem cells is unknown. $Vav_Atg5^{-/-}$ mice that have defective autophagy function in HSCs due to Atg5 depletion showed survival defect and reduced number of HSCs. Furthermore, multi-lineage progenitor cells and differentiated immune cells and erythrocyte from Vav_Atg5 were not well differentiated compared to WT mice. Also, Atg5 defective HSCs had more accumulated mitochondria and higher ROS level and it leaded to increased apoptosis in late differentiation stage of HSCs. Although HSCs from $Vav_Atg5^{-/-}$ mice showed higher proliferation ratio than normal HSCs, their reconstitution ability were reduced. These data mean Atg5 dependent autophagy is crucial for maintenance of number and function in HSCs.
조혈모세포 (Hematopoietic stem cell)는 골수에 niche를 이루고 있으며 다양한 면역 세포 및 적혈구를 생성함으로써 조혈기능을 담당하는 세포이다. 조혈모세포는 자가 복제 (self-renewal) 능력 및 전구세포를 거쳐 여러 세포로 분화 (differentiation)할 수 있는 능력을 가지고 있어 평생 동안 일정한 수를 유지하면서 매일 수많은 혈구세포를 생산한다. 평소 조혈모세포는 조혈과정에서 일정하게 분열 및 분화가 일어나는 항정상태 (steady state)를 유지하는데, 이 상태에 불균형이 일어나게 되면 혈구세포의 양적. 질적 이상이 초래되고 결과적으로 빈혈 및 혈액암 등 각종 질환의 원인이 된다. 따라서 조혈모세포의 조절기작에 대한 자세한 연구가 필요하다. 오토파지는 자가포식 작용으로 오래된 세포 내 물질들을 리소좀으로 이동시켜 분해하는 과정을 일컫는다. 오토파지는 세포의 항상성 유지 및 에너지 공급뿐 아니라 노화 및 면역반응에도 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. Atg5는 오토파고좀 (autophagosome) 연장 (elongation)에 관여하는 단백질로 오토파지 기능에 필수적인 단백질 중 하나이다. Atg5의 역할을 통해 오토파지가 조혈모세포에서는 어떠한 역할을 담당하는지 이번 연구를 통해 그 기능을 알아보고자 하였다.
Atg5 유전자 발현을 조혈모세포 특이적으로 제거하기 위해 조혈세포에서만 발현하는 vav 유전자의 특성을 이용하여 $Atg5^{flox/flox}$ 쥐 와 Vavi-cre 쥐를 교배시켜conditional knock out쥐를 만들어 실험에 사용하였다. 실험 결과 오토파지 기능이 일어나지 않는 조혈모세포는 세포 분열이 정상보다 활발하게 일어나고 있음에도 불구 하고, 그 수가 크게 감소하였을 뿐만 아니라 전구세포 및 최종적으로 분화된 면역세포 및 혈구 세포까지 그 수가 감소하거나 정상과는 다른 분화단계를 거침을 확인 해 볼 수 있었다. 이를 통해 오토파지가 조혈모세포의 분화 (differentiation) 및 분열 (proliferation)을 통한 세포 수 유지에 크게 관여함을 확인 해 볼 수 있었다. 그리고 Atg5가 결여된 조혈모세포는 오토파지 기능이 일어나지 않음으로 인해 세포 안에 많은 미토콘드리아가 축적 되어 있었으며 이에 따라 증가된 ROS를 측정 할 수 있었다. Annexin V 염색을 통해 세포사멸 (apoptosis) 정도를 확인 한 결과, $Vav_Atg5^{-/-}$ 쥐의 조혈모세포 및 전구세포가 포함되어 있는 LSK ($lineage^-$, $c-kit^+$, $sca-1^+$)부분에서는 세포사멸이 감소되어 있었지만 오히려 lineage 네거티브 부분에서는 세포사멸 정도가 증가한 모습을 관찰 할 수 있었다. 이를 통해 초기 분화 과정 단계를 지나 후기 분화 단계 시기에 이르렀을 때, 축적된 미토콘드리아 및 증가된 ROS가 세포사멸을 유도하였을 것이라고 생각된다.
또한, 이식된 조혈모세포는 이식한 개체의 골수로 들어가 조혈계(hematopoietic system)를 재구성 할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이러한 조혈모세포의 기능을 확인해 보기 위해 치사량의 방사선을 맞은 쥐에게 정상 쥐 및 $Vav_Atg5^{-/-}$ 쥐의 골수 세포를 채취한 후 각각 이식 해주어 카이메라 (Bone marrow chimera) 쥐를 만들었다. 8주 후 카이메라 마우스의 말초혈액을 이용하여 이식 받은 조혈모세포의 재구성 정도를 확인 해 본 결과, $Vav_Atg5^{-/-}$ 쥐의 조혈모세포의 조혈계 재구성 정도가 정상에 비해 감소한 모습을 볼 수 있었다.
위의 실험들로부터, 오토파지는 조혈모세포의 분열 및 분화를 통한 항정 상태 유지뿐만 아니라 조혈계를 구성하는 기능에 중요한 작용을 한다는 역할을 알 수 있었다. 위 연구는 조혈모세포의 유지 기작에 대한 오토파지의 역할을 확인함으로써 조혈모세포의 분화 및 증식의 항상성 유지에 대한 정보를 제공한다.
