Metabolic engineering has gained much recognition as an alternative to conventional petrochemical processes by producing industrially valuable chemicals through genetically engineered microorganisms. The grand objective of metabolic engineering is to reduce the reliance of modern societies on the petroleum and its refinery processes that have caused devastating environmental effects. Although state of the art gene manipulation techniques keep emerging, enabling better control of the microbial phenotypes, it is still considerably difficult to determine which biosynthetic pathways to use for the overproduction of a target chemical. This problem becomes more complex when it comes down to the production of chemicals not producible in the widely used microbial hosts (e.g., Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae). To handle this problem, several computational systems that design novel biological pathways have been introduced Biochemical Network Integrated Computational Explorer (BNICE), DESHARKY and RetroPath. In the case of the BNICE, it was implemented to identify a wide range of possible reactions, including not only previously known reactions, but also novel ones for the biosynthesis of 3-hydroxypropanoate (3-HP), a high-value chemical in industry. However, many computational platform systems, including the BNICE, generate a tremendous number of candidate biosynthetic pathways based on the nature of their reaction rules, without systematic prioritization of the predicted pathways for their feasibility in a real cell. A large number of the generated candidate biosynthetic pathways are extremely difficult to compare with one another, and prioritize. In order to resolve this issue, we developed a pathway prediction systems called EnzMatcher, which not only generates novel biosynthetic pathways to produce non-natural chemicals based on the chemical reaction mechanism, but also examines their feasibility and efficiency by considering two prioritization factors, namely structural similarities of the involved chemicals and thermodynamic favorability. We demonstrate prediction capacity of the platform by generating biosynthetic pathways for the two industrially important chemicals, 6-aminocaproic and acrylic acids. Also, we show that this pathway designing system can suggest biosynthetic pathways of several target chemicals, which are known to be impossible to produce in biological system, such as primary amines, 2-butanone, three branched-carboxylic acids; isobutyrate, isovalerate and 2-methylbutyrate. In this work, we present the successful case study of design, appropriate selection and experimental validation process of novel biosynthetic pathways by in vivo production of non-natural chemicals including primary amines, 2-butanone, isobutyrate, isovalerate and 2-methylbutyrate, all industrially important chemicals and some of which is not reported to be produced in microorganisms. This pathway generation system should be a useful tool in systems metabolic engineering
지난 세월동안 타겟 (target) 화합물을 효율적으로 생산하기 위한 대사 경로의 예측을 위해 수많은 시스템대사공학적인 플랫폼이 개발되어왔다. 이러한 플랫폼들은 대사 경로의 예측하는 방법에 있어서 기본이 되는 고유의 논리의 차이에 따라 다양한 접근 방법을 채택하고 있다. 그 접근 방법들에는 화합물 구조의 변화에 기반을 둔 것, 효소에 대한 정보에 기반을 둔 것, 반응 메카니즘에 기반을 둔 것 등이 있다. 하지만, 각각의 방법들은 한 가지 접근법만을 사용했을 때에 장점과 단점을 동시에 가지고 있어서 우리는 여러 가지 접근법을 통합하여 대사 경로를 예측하고 후보 효소군 (enzyme candidates) 을 제안해줄 수 있는 신 생합성 경로 예측 플랫폼을 만드는 일을 수행하였다. 이 플랫폼의 주요 원리는 원하는 타겟 화합물을 프로그램에 입력하면, 프로그램 내에 있는 리액션 룰 셋(Reaction rule set)에 의해서 생화학적으로 기 존재하는 반응 패턴에 따라 나올 수 있는 화합물들을 모두 생성해준다. 이러한 작업을 생성된 화합물에 다시 반복적으로 적용하여 기 존재하는 대사 경로와의 연결점을 찾을 때까지 반복 수행을 한다. 이렇게 생성된 수많은 새로운 대사 경로들은 단순히 반응의 구조적인 변화 패턴에만 기반한 것이므로 실제로 이러한 반응들이 세포 내에서 일어날 가능성을 평가하기 위한 스크리닝 (Screening) 과정을 거친다. 이러한 스크리닝 과정에서 평가 항목으로 쓰이는 다섯 가지 요소가 있는데 그것은 결합 위치의 유사성 (binding site covalence), 화학적 유사성 (chemical similarity), 열역학적 선호도 (thermodynamic favorability), 경로 길이 (pathway distance), 종 특이성 (organism specificity) 이다. 이렇게 다섯 요소들로 이전 과정에서 생성된 수많은 대사 경로들을 높은 점수 순서대로 등급을 매겨서 실제 세포 내에서의 발현 가능성을 제시해 줌으로서 실험적 전략을 제시한다. 이 플랫폼을 이용하여 산업적으로 가치 있으면서 아직 생화학적인 경로로는 생산이 보고된 바가 없는 여러 가지 신규 물질들의 생합성 경로를 새로이 디자인하였다. 새로 디자인한 신규 물질들은 1차 아인, 2-부타논, 아이소부티르산, 아이소발레릭산 그리고 2-메틸부티르산으로서, 여러 가지 pathway가 예측되었으며 이들 중에서 후보 엔자임들이 feasible한 pathway들을 따로 선별하였다. 각 step 마다의 특정 후보 엔자임과 해당 균주들 선정하여 대장균의 대사회로에 도입하였고, 그 결과 선정된 후보 엔자임들에 의해서 실제로 대장균 내에 신규 생합성 경로가 작용하여 기존에 생산되지 않았던 위의 물질들을 성공적으로 생산하였다.
