Dna2 is a nuclease/helicase that is involved in multiple DNA transactions including Okazaki fragment processing, double-strand break resection, and S-phase checkpoint activation. Since Dna2 plays a key role in many cellular processes, major efforts have been concentrated to elucidate its signaling network, mainly by identification of Dna2 interacting partners. In this study, we found that Cdc7/Dbf4, an essential kinase complex that plays crucial roles in the initiation of DNA replication and cell cycle progression in eukaryotes, physically interacts with Dna2 in a yeast two-hybrid screening. In addition, purified recombinant Dna2 and Cdc7/Dbf4 were able to bind each other in ELISA assays. We also present evidence that the Cdc7/Dbf4 kinase complex efficiently phosphorylated Dna2 both in vitro and in vivo. The phosphorylation of Dna2 by Cdc7/Dbf4, which occurred primarily at the N-terminal region of Dna2, resulted in decreased binding of Dna2 to flap DNA substrates, thereby lowering its endonuclease activity in vitro. Moreover, we show that Dna2, when expressed in a multi-copy plasmid, rescued the temperature-sensitive growth defect of the cdc7-4 and dbf4-1 mutants and that overexpression of Dna2 allowed cell-cycle arrested dbf4-1 mutant cells to efficiently progress into S phase in a manner dependent on the Mec1 kinase. This required the functional interactions between Dna2 and Mec1 since the Trp128 and Tyr130 residues of Dna2 were essential for the activation of the Mec1 kinase. Our results demonstrate for the first time that there is a functional link between Dna2 and the cell cycle kinase complex Cdc7/Dbf4. They interacted both genetically and physically, and these interactions are important for the timely progression of S-phase in a Mec1-dependent manner.
Dna2는 오카자키 조각 처리, 이중 가닥 절단 절제 및 S- 단계 검사 점 활성화를 비롯한 여러 DNA 거래에 관여하는 핵산 분해 효소 / 헬리 케이즈입니다. Dna2는 많은 세포 과정에서 중요한 역할을하기 때문에 주로 Dna2 상호 작용 파트너의 동정에 의해 신호 네트워크를 밝히기위한 집중적 인 노력이 집중되어왔다. 이 연구에서 우리는 진핵 생물에서의 DNA 복제 및 세포주기 진행에 중요한 역할을하는 필수 키나제 복합체 인 Cdc7/Dbf4가 효모 2 중 하이브리드 스크리닝에서 Dna2와 물리적으로 상호 작용한다는 것을 발견했습니다. 또한, 정제 된 재조합 Dna2 및 Cdc7/Dbf4는 ELISA 분석에서 서로 결합 할 수 있었다. 우리는 또한 Cdc7/Dbf4 키나아제 복합체가 시험 관내 및 생체 내에서 Dna2를 효율적으로 인산화한다는 증거를 제시한다. Dna2의 N- 말단 부위에서 주로 발생하는 Cdc7/Dbf4에 의한 Dna2의 인산화는 DNA 기판을 플랩 (flap)하기 위해 Dna2의 결합을 감소시킴으로써 시험 관내에서 그의 엔도 뉴 클레아 제 활성을 저하시킨다. 또한, 다중 복사 플라스미드에서 발현 될 때 Dna2가 cdc7-4 및 dbf4-1 돌연변이 체의 온도 민감성 성장 결함을 구제하고 Dna2의 과발현이 세포주기 정지 된 dbf4-1 돌연변이 세포를 효율적으로 허용한다는 것을 보여준다 Mec1 키나아제에 의존하는 방식으로 S기로 진행한다. 이것은 Dna2의 Trp128 및 Tyr130 잔기가 Mec1 키나아제의 활성화에 필수적 이었기 때문에 Dna2와 Mec1 사이의 기능적 상호 작용을 필요로했다. 우리의 결과는 Dna2와 세포주기 키나제 복합체 Cdc7/Dbf4 사이에 기능적 연결이 있음을 처음으로 입증합니다. 그들은 유전 적으로나 물리적으로 상호 작용을하며, 이러한 상호 작용은 Mec1에 따라 S 상을 적시에 진행시키는 데 중요합니다.