Perturbation of signaling networks by inhibition of target proteins can elucidate complex signaling networks in diverse cellular behaviors. To date, approaches such as knock-out/knock-down and small molecule inhibitors have been widely used to achieve these tasks. However, these techniques suffer from critical limitations, including slow responses, low reversibility, and poor spatiotemporal resolution. A technique that is capable of inactivating target proteins in a rapid, reversible, and highly spatiotemporal manner could crucially facilitate the study of target protein functions in the dynamic intracellular environment. In chapter 1, I developed a versatile optogenetic system for inhibiting protein function in living cells using light, Light-Activated Reversible Inhibition by Assembled Trap (LARIAT). By concerted application of multimeric protein and blue light-mediated interactions between Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 and CIB1, I sequestered target proteins into clusters and thereby inactivate target proteins upon light illumination. Using LARIAT, I effectively and reversibly inactivated guanine nucleotide exchange factor, Rho GTPases, PI3kinase and microtubule with high spatiotemporal resolution. I also employed single-domain antibodies to further expand this platform to inhibition of target proteins containing specific epitopes. In chapter 2, I present a single-component optogenetic module that allows rapid and efficient protein clustering to overcome a potential limitation of LARIAT. By conjugating fluorescent proteins and extending a short peptide (termed A9), I achieved superior CRY2 clustering. I demonstrated that quaternary structures of tagged proteins as well as their conjugation site influenced the light-induced CRY2 clustering property. I also identified a veiled role of the C-terminal region of CRY2, showing that extending the C-terminus of CRY2 increased the efficiency of CRY2 clustering. Moreover, this improved module remarkably enhanced the function of a previously reported optogenetic system. This novel optogenetic approach provides an unprecedented opportunity for exquisite perturbation of signaling networks with high spatiotemporal resolution and further expand the optogenetic toolbox.
세포 내의 단백질들의 기능을 규명하기 위해 그 동안 연구자들은 유전적인 방법 또는 약물을 처리하는 방법 등을 사용하였으나 여러 한계점들이 있었다. 이러한 한계점들을 극복하기 위한 방안으로 본 학위논문에서는 빛으로 단백질의 기능을 저해하는 광유도 분자올가미 기술 개발 및 적용에 관하여 다루고자 한다. 제 1장에서는 기술의 개발과 기술적인 특성을 규명하는 것에 대한 내용이다. 본 기술은 다중체 단백질과 빛에 반응하는 식물 단백질의 상호작용을 이용하여 단백질의 기능을 저해한다. 본 기술을 이용하여 세포의 분열, 성장, 이동 등에 관여하는 다양한 단백질들의 기능을 특이적으로 저해 할 수 있었다. 제 2장에서는 본 기술의 잠재적인 단점을 진단하고 단일 유전체로 단백질 복합체를 형성하는 방법을 통한 해결책을 제시하는 내용이다. 형광단백질과 펩타이드를 이용하여 크립토크롬2 만으로 빠르고 효율적인 복합체 형성을 이루어 냈으며 이를 적용하여 기존 기술들의 기능을 더 빠르게 향상 시킬 수 있었다.