Toll-like receptor 4 (TLR4)-myeloid differentiation factor-2 (MD-2) complex plays a critical role in host pro-tection against Gram-negative bacterial infection. Recognition of lipopolysaccharide (LPS), a toxic compo-nent of the outer membrane of Gram-negative bacteria, by TLR4-MD-2 evokes innate immune response. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) and cluster of differentiation 14 (CD14) sequentially mediate LPS transport from LPS aggregate to TLR4-MD-2. Although crystal structure of LBP, CD14, and TLR4-MD-2 complex have been determined, molecular mechanisms underlying the LPS transfer cascade remain unclear. To elucidate the mechanisms, we characterized dynamic interactions among the proteins and LPS in each intermediate step of the LPS transport process using negative-stain transmission electron microscopy (TEM) and single molecule fluorescence analysis. We found that LBP bound longitudinally to the surface face of LPS micelle via its six basic residues (Lys-67, Lys-68, Arg-73, Arg-119, Lys-120, and Lys-124) in its N-terminal tip. The binding of LBP to LPS micelle was required for interaction of CD14 with LBP. Notewor-thy, while a LBP stayed in binding to a LPS micelle, two basic residues (Lys-319 and Arg-322) in the C-terminus of LBP interacted with two acidic amino acids (Asp-251 and Asp-297) on the concave surface of CD14. A LPS micelle-bound LBP transferred a LPS molecule to CD14 monomer repetitively without detach-ing from the micelle. Repulsion between Asp-311 of LBP and an acidic patch in concave region of N-terminus of CD14 resulted in swift detachment of CD14 from LBP after obtaining LPS. In addition, we found that LRR13 and LRR14 of TLR4 were essential for transport of LPS from CD14 to TLR4-MD-2 complex. Collectively, our results provide structural and molecular mechanistic insights into the LPS transport from LPS micelles to TLR4-MD-2 via LBP and CD14.
TLR4-MD-2 복합체는 그람음성균의 외막에 존재하는 독성물질인 지질당 (LPS)을 인식하여 선천성 면역반응을 일으킨다. 지질당 결합단백질 (LBP)과 CD14 단백질들은 차례로 작용하여 지질당 덩어리들로부터 지질당 분자를 TLR4-MD-2 복합체로 효율적으로 전달해 주는 역할을 한다. 지질당이 지질당 결합단백질, CD14, TLR4-MD-2를 거치면서 전달되는 분자적 기작을 밝히기 위해 본 연구에서는 음성염색 투과전자현미경기법과 단분자 형광 분석법을 이용하여 지질당이 전달되는 과정에서 생기는 지질당과 단백질들 사이의 상호작용들을 분석하였다. 그 결과, LBP와 지질당 마이셀의 결합 구조 및 방식, CD14와 LBP의 정전기적 인력에 의한 결합, 하나의 LBP를 통해 지질당들이 CD14들로 전달되는 방식, 지질당이 전달된 후 LBP와 CD14가 정전기적 반발력에 의해 신속히 분리되는 기작, 지질당이 TLR4 의존적으로CD14에서 TLR4-MD2 복합체로 전달되는 방식 등을 밝혀 내었다. 이 연구 결과는 지질당이LBP와 CD14를 거쳐 TLR4-MD-2 복합체로 전달되는 과정을 구조적 및 분자적으로 이해하는 데에 큰 역할을 할 것으로 기대된다.