As the increasing demand from chemical and fuel markets, the interest in producing n-butanol using biological route has been rejuvenated to engineer an economical fermentation process, competing with the chemical synthesis. In addition to the traditional researches of understanding and engineering the n-butanol producer, Clostridium, to be more effective at producing solvents at the economically feasible level, one can transfer this synthesis pathway into more advanced hosts and optimize it with available engineering tools. It has been demonstrated that Escherichia coli is an appropriate alternative host for n-butanol pathway and it has become the second most effective host since the last 5 years of intensive study. Considering the feasibility to scaling up a fermentation process, beside the high efficiency of the synthetic pathway, how the host can be easily controlled and adapted to the industrial conditions is also very critical. The fact that n-butanol is very toxic to most of the commonly known microbial hosts, including Clostridium and E. coli is considered as a major drawback limiting the ability of this process to be expanded to the industrial scale. Having successfully improved the n-butanol tolerance of E. coli employing our Artificial Transcription Factor (ATF), we have sought other means to further increase the limit of E. coli tolerance and, at the same time, introduced and improved a heterologous n-butanol pathway in E. coli to justify the role of n-butanol tolerance with the whole process. Since the n-butanol tolerant ATF was based on a random approach, we applied rational strategies to complement it, including controlling the membrane fatty acid composition, overexpressions of molecular chaperones, efflux system, and iron uptake. On the other hand, a DNA scaffold system for creating an enzymatic cascade was constructed using our library of DNA-binding zinc finger proteins to facilitate the butanol synthesis pathway. Putting together, the use of ATF in combination with iron uptake protein and high membrane unsaturated fatty acid extended the ability of E. coli to tolerate up to 2% n-butanol, supporting the rapid enzymatic cascade generated by DNA scaffold system and improving the final n-butanol production.
생물학적 경로를 사용하여 n- 부탄올 생산은 발효 공정설계단계로 진입하였는데 화학 및 연료 시장에서의 수요 증가로 기존의 화학 합성방법과 같이 많은 관심을 받고 있다. 현재 n-부탄올 생산에 사용되는Clostridium을 개선하여 공업에 적합한 생산율로 높이는 연구가 많이 진행 되고 있으며 또한 동시에 더 효율적인 호스트에 대한 부탄올 합성경로 엔진니어링 과 최적화에 대한 연구도 진행되고 있다. n-부타놀의 합성경로가 E.coli에서도 실행할 수 있다는 것이 밝혀졌지만 n-부타놀의 호스트인 Clostridum과 E.coli에 대한 고 독성이 이들을 이용한 n-부탄올의 공업적인 대량 생산을 제한하고 있다. 그리하여 우리는 인공전사이자 [Artificial Transcription Factor (ATF)] 방법을 이용하여 n- 부탄올 에 대한 E.coli의 내성을 1.5%[v/v]까지 향상하였다. n- 부탄올 내성 ATF는 랜덤 방식에 기초하고 있기 때문에 우리는 또 지방산 조성 제어, 분자 샤페론 과발현, 부타놀 발산 시스템 및 아이언 흡수 등 여러 방식을 결합하여 n-부탄올에 대한 E.coli의 내성을 높이는 연구를 수행하였다. 그리고 우리는 E.coli의 내성을 증가하는데 초점을 둘 뿐만 아니라 또한 징크핑거 단백질 라이브러리를 이용하여 만든 DNA 골격 시스템으로 효소 캐스케이드를 구축함으로써 부탄올 합성경로도 최적화 하였다. 최종적으로ATF 사용, 아이언 흡수조절 과 불포화 지방산함량 증가 등 방법을 이용하여 E.coli의 n-부탄올에 대한 내성을 2%로 높임으로써 DNA 골격 시스템을 이용한 n-부탄올 생산을 사용하지 않았을 때보다 2 배로 높였다.
