A diamine is a chemical that contains two amino groups. Diamines are important raw materials with a wide range of applications in the chemical industry. Diamines have been widely used in the production of pharmaceuticals, cosmetic materials, agrochemicals, surfactants and other additives. In this research, we focus on the efficient production of C3-C5 diamines, C3 1,3-diaminopropane, C4 putrescine (or 1,4-diaminobutane), and C5 cadaverine (or 1,5-diaminopentane).
Putrescine, 1,4-diaminobutane, is a native metabolite found in several bacteria at physiological level such as E.coli spp., Bacillus spp. etc. In this study, production of putrescine has been achieved through rational pathway design and systems metabolic engineering using in silico simulation. First, to improve production of putrescine, we use amplification targets by using in silico simulation. Among the targets, we selected 5 genes that are more effective in improving putrescine production than the control strain in a flask culture test. The engineered E.coli strains with individually amplified acnA, acnB, ackA, glk, or ppc were able to produce 1.90g/L, 1.89g/L. 2.04g/L, 2.23g/L and 2.06g/L, respectively, of putrescine in a batch Fermentation. Fed-batch fermentation of these strains led to the enhanced production of putrescine up to 30g/L on average. Second, to increase production of putrescine, we use knock-out targets by using in silico simulation. Third, to reduce acetate formation during fed-batch cultivation, ackA and poxB gene were deleted, respectively. The combinatorial strains produced putrescine with a titer of ca. 2.15g/L in the culture medium of the batch cultivation on average. Cadaverine and 1,3-diaminopropane are same approach as a production of putrescine.
In summary, these improvements make up a new starting point for the construction of more efficient industrial strains for diamine production in E.coli.
Diamine은 양쪽에 아미노기를 가지고 있는 화합물로서, 일반적으로 질소를 포함하고 있는 화합물을 이용하는 화학 산업에서 많이 이용되는 물질이다. Dia-mine은 크게 지방족 다이아민(aliphatic diamine)과 방향족 다이아민(aromatic diamine)으로 나눌 수 있는데, 화학 산업에서는 일반적으로 지방족 다이아민이 많이 사용된다. Diamine은 질소를 포함하는 화합물의 산업에서 이용될 뿐만 아니라, 의약품, 진단시약, 계면활성제 그리고 기타 첨가제 등에도 많이 사용되어 왔다. 본 연구에서는, 탄소수 4개인 putrescine(또는 1,4-diaminobutane), 탄소수 5개인 cadaverine(또는 1,5-diaminopentane), 그리고 탄소수 3개인 1,3-diaminopropane 이 세가지 물질을 시스템 대사공학적 연구를 적용하여 생산량을 증가시키는 전략에 초점을 맞추고 있다.
Putrescine 과생산과 관련하여서는, 본 연구팀의 putrescine 생산 균주인 XQ52 균주를 기반으로 연구를 진행하였고, 이 균주 데이터를 기반으로 in silico knock-out simulation 및 amplification simulation을 진행하였다. in silico simulation 결과 나온 target을 조합한 결과 putrescine 생산량을 기존 생산량 대비 약 30% 증가한 것을 확인할 수 있었다.
Cadaverine 과생산과 관련하여서는, 본 연구팀의 cadaverine 생산 균주인 XQ56 균주를 기반으로 연구를 진행하였고, 이 균주 데이터를 기반으로 인실리코 knock-out simulation 및 amplification simulation을 진행하였다. in silico simulation 결과 나온 target을 조합한 결과 cadaverine 생산량을 기존 생산량 대비 약 30% 증가한 것을 확인할 수 있었다.
1,3-diaminopropane은 Escherichia coli에서 native하게 생산할 수 없는 산물로서, 오직 병원성 세균인 Acinetobacter baumannii와 Pseudomonas aeru-ginosa에서 발견된다. 먼저, 1,3-diaminopropane을 생산하기 위해서 이 두 가지 세균의 유전자들을 이용하여 대사공학적으로 조작하였다. 하지만 병원성 세균이라는 특징 때문에 1,3-diaminopropane을 생산하는데 어려움이 있었다. 이 두 가지 세균 중에서 A. baumannii의 합성 경로를 대장균에 적용하여 1,3-diaminopropane을 생산하였다. 기본 균주는 본 연구팀의 쓰레오닌 생산 균주를 기반으로 제작되었고, A. baumannii의 합성 경로를 포함한 데이터를 기반으로 in silico knock-out simulation 및 amplification simulation을 진행하였다. in silico simulation 결과 나온 target을 조합한 결과 1,3-diaminopropane 생산량을 기존 생산량 대비 약 30% 증가한 것을 확인할 수 있었다.
그리고 새로운 접근 방법으로, putrescine tolerance를 증가시키기 위해서 small RNA(sRNA)를 도입하였다. sRNA을 도입한 결과 tolerance를 기존의 문헌에 나와있던 44g/L 에서 70g/L까지 증가시킬 수 있었다.
요약하면 과량 생산하기 위해서 고안한 방법들이 대장균에서 diamine을 산업적으로 효율적인 균주를 구축 하는 데에 밑거름이 될 수 있다는 것이다. 또한 본 연구에서 제시된 전략들은 diamine의 과생산뿐만 아니라 같은 다른 product 의 과량 생산에도 적용할 수 있을 것으로 생각된다.