Recently, immune cell therapy has attracted attention as a therapeutic alternative to refractory cancer. In particular NK cells are promising tool that can be used both autologous and allogeneic without further genetic modification. In order to apply NK cells to clinical application, it is essential to culture high-purity and high-efficacy NK cells in large quantities. For this reason, it is very important to develop an optimal strategy for large-scale NK cell expansion. In this study, we investigated the role of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) as feeder cells, which are key technology for ex vivo NK cell expansion, and key factors, which are important for NK cell proliferation. In addition, we have developed a powerful feeder cells that can replace PBMC feeder cells and apply for large-scale NK cell expansion.
We confirmed that $CD4^+ T$ cells directly contribute to NK cell proliferation among a variety of cells present in PBMC. And we have also identified that OX40, 4-1BB, and transmembrane $TNF-\alpha(mTNF-\alpha)$, which are inducible after NK cell activation, play an important role as NK cell receptors involved in NK cell proliferation. Especially, blocking of OX40 and 4-1BB signals completely inhibited proliferation and survival of NK cells in NK cell expansion.
To expand NK cells in large quantities, it is necessary to stimulate feeder cells repeatedly, thus a large amount of PBMCs are used as feeder cells for this purpose. We assessed NK cell proliferative potential using seven kinds of T cell lines, which possess T cellcharacteristics, to develop feeder cells capable of replacing PBMCs and selected the $CD4^+ T$ cell line, HuT 78. HuT 78 cells exhibited equal to or higher NK cell proliferative capacity than PBMCs. To develop powerful feeder cells, we generated genetically engineered feeder cell line by transducing one to four gene combinations of OX40L, 4-1BBL, $mTNF-\alpha$ and membrane bound IL-21 (mbIL-21) into HuT 78 cells and assessed NK cell expansion. HuT 78 cells expressing 4-1BBL, $mTNF-\alpha$, and mbIL-21 was selected as feeder cells for ex vivo expansion of NK cells. 4-1BBL/$mTNF-\alpha$/mbIL-21- HuT 78 feeder cells induced millions of folds of NK cell proliferation through repeated stimulation of them, and expanded NK cells retained in vitro efficacy equivalent to several thousand-fold of expanded NK cells. In addition, NK cells expanded with PBMCs and 4-1BBL/$mTNF-\alpha$/mbIL-21-HuT 78 cells were exhibited equivalent anti-tumor efficacy despite the big difference in NK cell proliferation.
In conclusion, we have shown that $CD4^+ T$ cells play an important role as feeder cells for NK cell cultivation and that OX40, 4-1BB, and $mTNF-\alpha$ signals are essential for NK cell proliferation. In addition, PBMC feeder cells can be replaced with genetically modified HuT 78 cells, which were transduced with 4-1BBL, $mTNF-\alpha$ and mbIL-21 (eHuT 78 cells), and we have been able to expanded clinically useful NK cells in large quantities using this eHuT 78 cells.
최근 난치성 암에 대한 치료적 대안으로 면역세포치료제가 주목을 받고 있으며 특히 자연살해 (Natural killer 또는 NK) 세포는 별도의 유전자 조작 없이도 자가와 동종 모두 사용할 수 있는 유망한 수단이다. NK 세포를 임상에 적용하기 위해서는 고순도, 고효능의 NK 세포를 대량 배양하는 기술이 필수적이며 이를 위해서는 최적의 NK 세포 체외확장배양 방법을 개발하는 것이 매우 중요하다. 이 연구에서 우리는 NK 세포 체외확장배양에 핵심적인 기술인 말초혈단핵구 지지세포의 역할과 NK 세포증식에 중요한 증식인자를 규명하고자 하였다. 또한 이를 응용하여 말초혈단핵구 지지세포를 대신할 수 있는 강력한 지지세포를 개발하여 NK 세포 대량 배양에 적용하고자 한다.
우리는 말초혈단핵구 내에 존재하는 다양한 세포군 중 NK 세포 증식에 직접적으로 기여하는 지지세포가 $CD4^+ T$ 세포임을 확인하였다. 그리고 NK 세포 증식에 관여하는 NK 세포 수용체로 NK 세포 활성 후 유도되는 보조자극분자인 OX40, 4-1BB, 그리고 transmembrane $TNF-\alpha$ ($mTNF-\alpha$)가 중요하게 작용하는 것을 규명하였다. 특히 NK 세포 배양 시 OX40와 4-1BB의 차단은 NK 세포의 증식과 생존을 완전히 억제하였다.
NK 세포를 대량 배양하기 위해서는 반복적인 지지세포의 자극이 필요하고 이를 위해서 많은 양의 말초혈단핵구가 지지세포로 사용되고 있다. 우리는 말초혈단핵구를 대체할 수 있는 지지세포를 개발하기 위해서 T 세포의 특성을 보유하는 7종의 T 세포주를 이용하여 NK 세포 증식능을 평가하였고 $CD4^+ T$ 세포주인 HuT 78 세포를 선정하였다. NK 세포 증식 평가 결과 HuT 78 세포는 말초혈단핵구 대비 동등 이상이었다. 보다 강력한 지지세포를 개발하기 위해서 HuT 78 세포에 OX40L, 4-1BBL, $mTNF-\alpha$ 그리고 membrane bound IL-21 (mbIL-21)을 1~4종까지 다양하게 유전자 도입하여 세포주를 제작하고 NK 세포 증식능을 평가한 결과 HuT 78 세포에 4-1BBL, $mTNF-\alpha$, 그리고 mbIL-21이 발현된 세포를 최종적으로 지지세포로 선택하였다. 4-1BBL/$mTNF-\alpha$/mbIL-21-HuT 78 지지세포는 반복적인 지지세포 자극을 통해 수백만 배의 NK 세포 증식을 유도하였고 증식된 NK 세포는 수천 배 증식된 NK 세포와 동등한 수준의 in vitro 효능을 보유하는 것을 확인하였다. 또한 항암 동물 모델을 통해서 말초혈단핵구와 4-1BBL/$mTNF-\alpha$/mbIL-21-HuT 78 지지세포로 배양한 NK 세포가 세포 증식 차이에도 불구하고 동등한 항암 효능을 발휘하는 것을 확인하였다.
결론적으로 우리는 NK 세포 배양을 위한 지지세포로 말초혈단핵구 중 $CD4^+ T$ 세포가 중요한 역할을 하며 NK 세포 증식을 위해서는 OX40, 4-1BB, $mTNF-\alpha$ 신호가 필수적임을 규명하였다. 그리고 말초혈단핵구 지지세포는 4-1BBL, $mTNF-\alpha$, mbIL-21이 도입된 HuT 78 세포로 대체될 수 있으며 이 지지세포를 사용해 임상적으로 유용한 NK 세포를 대량으로 배양할 수 있게 되었다.
