It is a prerequisite for effective systemic delivery of target to identify and recognize specific molecules that can target cells with a high affinity and specificity. Moerover, avoiding phagocytosis mechanism by macrophage is also important for delivery. In order to delivery systems to be effective for treatment, it is necessary to satisfy the following two conditions: passive and active targeting. It should be possible to reach target tumor tissues through various anatomical or immunological barriers without loss of drug in the blood stream after administration. Moreover, after reaching the target, only target cells should be selectively killed. These two basic strategies also play a role in improving patient survival and quality of life by reducing the toxicity that increases the intracellular concentration of the drug and at the same time limits the therapeutic concentration of the drug. Here, I demonstrate the interaction between biomolecules and ligands. First, I introduce a self-peptide on capsid of T7 bacteriophage for effective phage therapy with their prolonged blood circulation by escaping from the phagocytosis of macrophages based on CD47 and SIRP alpha interaction. Second, molecular dynamic simulation is used to identify the target peptide ligand due to the structural change of the P2 beta-sheet that occurs when the fibrinogen is changed to fibrin. The novel heptameric peptide has a linear structure with proline residue fixation. To confirm this experimentally, recombinant protein of fibrinogen gamma module and truncated fibrinogen gamma module without P2 beta-sheet are produced. FPLC is used to confirm that the peptides excavated in vacancy caused by removal of P2 beta-sheet are specifically bound. Third, I evaluate and utilize the fibrin-binding peptide that can specifically and strongly target fibrin deposited around A549 human lung carcinoma because of high expression level of fibrinogen mRNA of A549. It shows high affinity of the targeting peptide specifically to A549 in vitro and in vivo. This will be promising properties for a targeted delivery of small molecular drugs, peptides, proteins, and nanocarriers to lung cancer cells. I expect that the targeting peptide can be utilized as a lung cancer targeting moiety having significant implications for the lung cancer targeted treatments. Moreover, I identify a novel peptide targeting islet cells of pancreas using biopanning with M13 phage display. This thesis focuses on the structural and functional changes of target proteins from a microscopic point of view, rather than macroscopic targeted ligand studies. It is expected that this mechanism-based ligand discovery research will become a basis for application to various fields. The identification and application of novel functional peptides are promising approach to improve in vivo targeting efficiency of various nanocarriers to specific affected area and the efficacy of therapeutic agents incorporated within the nanocarriers.
질병의 진단이나 치료를 위한 이미징 물질 혹은 약물을 몸 안의 특정한 세포, 조직, 분자에 특이적으로 전달하여 세포 내 기능을 변화시키고자 하는 노력은 계속되어 왔다. 그러나, 많은 기술들이 뛰어난 in vitro 효과를 보임에도 불구하고 in vivo에서는 매우 제한된 성능을 보여주었다. 이는 몸 안으로 주입된 성분들이 생체 면역 반응에 의해 빠르게 제거 되어 그 효율이 매우 낮아지거나 비특이적 결합으로 질병소에 도달하지 못하는 등의 체내 장벽 요인 때문이다. 아직 일반적인 약물전달 시스템에서도 수동적 전달에 많은 부분을 의존하고 있을 뿐 아니라, 능동적 전달을 위한 엽산 등의 물질도 물질의 소수성(疏水性)이나 분해 등으로 인해 본질적으로 높은 타겟팅이 어려운 실정이다. 위와 같은 문제를 해결하고 효율적으로 약물 및 이미징 물질을 전달하기 위해 대식세포에 의한 식균작용을 피해 오랫동안 체내 순환하여야 할 뿐 아니라 타겟에 높은 친화도와 특이성을 갖는 물질 개발이 필수적이다. 본 논문에서는 특정 생체 물질을 표적하는 펩타이드를 발굴하고 이를 분자 수준, 세포 수준, 그리고 동물 모델에 적용하여 그 특이적 결합을 확인해 이를 바이오 이미징 및 파지 치료법 등의 응용 분야에 활용할 수 있음을 보여주었다.
첫째로, 용균성 T7 박테리오파지의 캡시드에 자가 펩타이드 (self-peptide)를 도입하여 대식세포의 식균 작용을 피해 연장된 혈액 순환을 가지는 효과적인 파지 치료법을 개발해 검증하였다. 파지 치료법은 과거부터 박테리아만을 특이적으로 없앨 수 있는 매우 안전한 치료법으로 쓰여왔으며 현재 널리 쓰이고 있는 항생제 치료의 내성 문제를 극복할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나, 파지는 체내의 대식 작용에 의해 빠르게 제거되어 치료 효율이 낮은 문제를 가지고 있다. 이를 해결하기 위해 CD47 단백질에서 유래한 자가 펩타이드를 유전공학적으로 T7 파지의 캡시드에 415개 균일하게 발현하여 혈액 내 순환 시간을 획기적으로 늘린 파지를 개발하였다. 이를 동물 감염 모델에도 적용하여 효과적 치료가 가능함을 보였다.
둘째로, 피브린 (fibrin)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 계산 과학적으로 발굴하고 실험적으로 검증하였다. 분자 역학 시뮬레이션을 통해 피브리노겐이 피브린으로 바뀔 때 발생하는 P2 베타 시트의 구조적 변화를 표적하여 펩타이드 리간드를 발굴하였다. 새로운 7 mer 펩타이드는 프롤린 잔기가 고정된 선형 모티프를 가지고 있으며 나머지는 소수성 잔기로 이루어져있다. 발굴 펩타이드의 특이적 결합능을 실험적으로 확인하기 위해, 피브리노겐 감마 모듈 재조합 단백질 및 P2 베타 시트가 없는 절단 된 피브리노겐 감마 모듈을 각각 제조 하였다. SEC, CD, SPR을 이용해 P2 베타 시트의 제거로 인한 발생한 공극에 발굴 된 펩타이드가 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
셋째로, 암의 전이와 악성화에 관여하는 피브린이 과발현되어 있는 폐암세포주 A549에 발굴한 피브린 특이적 결합 펩타이드를 적용하여 결합을 확인하였다. A549 세포주는 높은 피브리노겐 mRNA의 발현수준을 가지고 있어 세포외기질에 과발현된 피브린을 축적해 암의 전이를 더 쉽게 하는 특징을 가지고 있다. 이러한 A549 세포를 표적으로 하여 세포 및 폐암 모델 실험동물에 신규 펩타이드를 도입해 A549 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 A549와 같이 암 사망률을 높이는 전이성 폐암에 효과적으로 이미징 물질이나 약물, 단백질, 나노 전달체 등을 전달하는 용도로 널리 사용될 수 있다.
마지막으로 M13 박테리오파지의 pIII 부분에 무작위로 7개의 아미노산이 발현되어 있는 라이브러리를 이용해서 췌장의 베타세포를 대상으로 바이오패닝을 진행해 세포 특이적 펩타이드를 발굴하였다. 기존 췌장 주변의 혈관을 타겟하는 펩타이드를 대신하여 직접적으로 췌장 베타세포를 표적하여 향후 당뇨병 진단이나 치료제 전달, 췌장 이식 후의 경과를 확인하는 용도 등으로 널리 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
신약개발의 리스크를 줄이면서도 신약과 같은 파급효과를 일으킬 수 있는 약물전달시스템 연구는 중요한 의미를 지니고 있다. 많은 연구자들이 효과적 약물전달을 위해 다각도로 연구를 진행하고 있으나 in vivo의 낮은 효율과 임상에서의 예상치 못한 부작용은 아직 극복해야할 과제로 남아있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는 단순한 결합 리간드 발굴에 그치지 않고 타겟과 리간드의 결합 메커니즘까지 자세히 알아야 한다. 본 연구는 기존의 거시적 타겟 리간드 발굴 연구에서 벗어나 미시적인 관점에서 타겟 단백질의 구조와 기능 변화에 집중하였다. 이러한 메커니즘 기반의 리간드 발굴 연구가 다양한 분야에 응용을 가능하게 할 밑거름이 될 것으로 기대한다. 또한, 본 연구에서 제시한 면역회피성 및 타겟 특이적 결합 펩타이드의 발굴과 적용은 in vivo에서 그 효과가 더욱 극대화되어 효과적 임상 적용이 가능할 것으로 생각한다. 더욱이 multivalent 결합을 유도할 수 있는 입자에 도입하면 질병소에 다양한 나노운반체의 in vivo 표적화 효율 혹은 나노운반체 내에 혼입 된 치료제의 효능을 개선시키는 유용한 접근법이 될 것으로 기대할 수 있다.