Antigenic properties of the major pre-S2 B-cell epitopes of the hepatitis B virus (HBV) surface antigen (HBsAg) were studied using a pre-S2 specific antiHBsAg monoclonal antibody (H8 mAb), anti-HBsAg polyclonal antibodies and synthetic peptides by competitive ELISA.
H8 mAb showed HBV subtype- and peptide size-dependent specificity against synthetic peptides. The HBV subtype-dependent specificity was correlated with a single amino acid substitution at position 141. The peptide, p120-145/adw2, substituted leucine for phenylalanine at the position 141 showed no antigenicity against H8 mAb. The peptide size-dependent specificity was correlated with residues 120/123-129. The truncated peptides excluding these residues, p130-145, showed very low antigenicity compared with p120-145, though the antibody binding site was found to be located in p130-145 by conjugation study. The antigenicity of p130-145 could be increased to the level of p120-145 when p130-145 was conjugated to proteins (bovine serum albumin or ovalbumin) or poly-amino acids (poly-L-glutamic acid or random copolymer of L-glutamic acid and L-alanine). The residues 120/123-129 of p120/123-145 seems to be involved in maintaining the high antigenicity of p120/123-145. In substitution studies of the residues in the sequence p120-129 of p120-145/adr, hydrophilic residues 124-126, STT, and a hydrophobic residue 127, phenylalanine, may play important roles in maintaining high antigenicity. In substitution studies of the residues in the sequence p120-129 of p120-145/adr, p6E-123, the residues 131, 137, 141 and 142, leucine, arginine, phenylalanine and proline, respectively, were identified to involve in the H8 mAb binding, but the residues 132 and 135, leucine and arginine, respectively, did not affect the antigenicity. These results suggest that H8 mAb recognizes a discontinuously conformational epitope included at least residues 131-142.
Antigenic properties of the pre-S2 region were also studied using antiHBsAg mouse and rabbit polyclonal antisera.
The mouse polyclonal antibodies showed a preference for the adr subtype (immunogen subtype) regardless of adjuvant used and recognized mainly continuous epitopes in the area covered by the sequence 130-145. The importance of each residue in the sequence 130-145 was studied using substituted peptides. The N-terminal and/or middle region in the sequence 130-145, especially positively charged arginine residues at positions 135 and 137, seemed to play important roles in the binding of the mouse polyclonal antibodies than the C-terminal region. The residue 134, proline, located at the N-terminal region did not affect the antigenicity compared with the residues 130-133 and 135, indicating that the antibodies responsive to this region may only recognize the backbone structure of proline.
The rabbit polyclonal antibodies also strongly reacted with the peptides with the sequence 130-145, but showed a preference for the long peptides, p120/123-145, with high antigenicity against H8 mAb, suggesting that the rabbit polyclonal antibodies also recognize preferentially the conformational specific epitopes. Unlike H8 mAb, however, their major binding sites are mainly located at the N-terminal region in the sequence 130-145, especially residues 133 and 135, aspartic acid and arginine, respectively.
The higher antigenicity of the long peptides, p120/123-145, when compared with the short peptides may be related to their conformational differences. The relationship between the antigenicity and structure was identified by probing their secondary structures by circular dichroism (CD). All shapes of the CD spectra of peptides showed random conformation in aqueous solution regardless of antigenicity, except p3E-120 which has the highest antigenicity against H8 mAb. However, at 20% trifluoroethanol (TFE) the long peptides with high antigenicity against H8 mAb showed more ordered structures including α-helix than the short peptides. The less ordered structure of p3A-120 than high antigenic peptides was correlated well with its low antigenicity against H8 mAb. These results showed the good relationship between the antigenicity and structure. The secondary structure of p120-145/adw2 showed the same
B형 간염 바이러스 (HBV) 표면항원 (HBsAg)의 주된 pre-S2 B 세포 항원결정기 부위의 항원성을 pre-S2 부위에 특이한 항 HBsAg 마우스 단일클론 항체 (H8 mAb) 및 마우스 및 토끼의 폴리클론날 항체들과 합성 펩타이드들을 사용하여 경쟁 면역 효소 분석법 (competitive ELISA)에 의해 연구하였다.
H8 mAb는 합성 펩타이드에 대해 HBV 아형 및 펩타이드 크기에 의존한 특이성을 보였다. HBV 아형에 의존한 특이성은 pre-S2 부위의 141번 위치의 아미노산 치환과 연관되어 있었다. 141번 위치의 phenylalanine이 leucine으로 치환된 p120-145/adw2 펩타이드는 H8 mAb에 대해 항원성을 나타내지 않았다. 펩타이드 크기에 의존한 특이성은 잔기 120/123-129와 연관되어 있었다. 이 잔기들이 제거된 p130-145 펩타이드들은 - 비록 접속 실험 (conjugation experiment)에 의해 H8 mAb 결합 부위가 p130-145에 존재하는 것으로 밝혀 졌지만 - p120-145 펩타 이드에 비해 대단히 낮은 항원성을 보여주었다. 접속 실험에서 p130-145를 소 혈장 알부민이나 난백 알부민 (ovalbumin)에 접속 시키거나 PE 및 PEA등과 같은 폴리 아미노산에 접속시킬때 그 접속체의 항원성은 거의 p120-145의 수준까지 증가되었다. 잔기 120/123-129는 p120/123-145 펩타이드의 높은 항원성 유지에 연관되어 있는 것으로 여겨진다. p120-145 펩타이드의 120-129의 서열내의 잔기들에 대한 치환 연구에서, 친수성 잔기 (STT) 및 소수성 잔기 127 (phenylalanine)이 p120/123-145의 높은 항원성 유지에 중요할 것이라 여겨진다. p120-145/adr 펩타이드나 p6E-123 펩타이드의 130-145 서열내의 잔기들에 대한 치환연구에서 잔기 131 (leucine), 137 (arginine), 141 (phenylalanine) 및 142 (proline)은 H8 mAb 결합에 중요한 것으로 밝혀졌으나, 잔기 132 (leucine) 및 135 (arginine)은 거의 H8 mAb 결합 에 영향을 주지 못하였다. 이 결과들은 H8 mAb가 잔기 131-142 사이에 포함된 비연속적으로 구조적인 항원 결정기를 인지함을 제시해준다.
항 HBsAg 마우스 및 토끼 폴리클론날 항체들에 대한 pre-S2 부위의 항원 특이성들도 합성 펩타이드를 이용하여 분석하였다.
마우스 폴리클론날 항체들은 사용된 adjuvant에 관계없이 adr 아형에 대한 선호도를 나타냈으며, 서열 130-145를 포함하는 연속적인 항원 결정기들을 주로 인지하였다. 치환된 펩타이드들을 이용하여 서열 130-145 내의 각각의 잔기들의 중요성을 분석한 결과, 잔기 135 및 137 위치의 arginine이 포함된 서열 130-145의 N-말단이나 중앙 부위가 C-말단보다 폴리클론날 항체들의 결합에 중요한 역할을 하였다. 잔기 134번의 proline은 잔기 130-133 및 135에 비해 항원성에 전혀 영향을 주지 않았는데, 이는 이잔기의 중축 (backbone) 구조만이 항체들과의 결합에 관여함을 제시해 준다.
토끼 폴리클론날 항체들도 서열 130-145를 포함하는 펩타이드들과 강하게 반응하였으나, H8 mAb와 비슷하게 긴 펩타이드 (p120/123-145)들에 대한 선호도를 나타내었다. 이는 이 폴리클론날 항체들이 구조적인 특이성이 있는 항원 결정기들을 더 잘 인식함을 알려준다. 그러나 H8 mAb와는 다르게 주로 서열 130-145내의 N-말단 부위에 중요한 항원결정기 부위가 존재하였으며, 특히 잔기 133 (aspartic acid) 및 135 (arginine) 이 중요하게 작용하였다.
짧은 펩타이드들과 비교할 때 긴 펩타이드들에 대한 높은 항원성은 그들간의 구조적인 차이에 연관되어 있을 것이라 여겨진다. 항원성과 펩타이드 구조간의 상관 관계는 CD에 의한 펩타이드의 2차구조를 분석하여 알아 보았다. 가장 높은 항원성을 보이는 p3E-120을 제외하고 펩타이드의 모든 CD 스펙트럼들은 수용액 상에서는 자유 구조를 나타내었다. 그러나 20% TFE에서는 항원성이 높은 긴 펩타이드들이 짧은 펩타이드들보다 α-helix가 포함된 보다 구조적인 양상들을 나타냈다. 높은 항원성을 지닌 펩타이드들 보다 p3A-120의 20% TFE에서 덜 구조적인 양상은 H8 mAb에 대한 p3A-120의 상대적으로 낮은 항원성과 좋은 연관관계가 있었다. 이 결과들은 항원성과 구조간에 높은 상관관계가 있음을 제시해준다. p120-145/adw2의 2차 구조는 높은 항원성을 나타내는 펩타이드들과 거의 같게 나타났는데, 잔기 141이 펩타이드에 구조 변화에는 영향을 미치지 않고 단지 H8 mAb와 직접적인 결합에 관여함을 알 수 있다.
