Selection of transcription start sites by E. coli RNA polymerase were studied by group mutation of promoter elements and functional amino acid residues of phage SP6 RNA polymerase were mapped by random mutagenesis of polymerase gene.
The first, the effects of single base pair substitutions within the initiation region (nucleotide positions -1, +1 and +2) and the -35 region (nucleotide positions from -36 to -31) of the lacUV5 promoter on transcription initiation site selection by E. coli were systematically studied. Transcription start sites were mapped by sizing cytidine specifically terminated transcripts produced by using 3'-deoxycytidine 5'-triphosphate instead of cytidine 5'-triphosphate in in vitro transcription reaction. Transcription of the lacUV5 promoter initiated with three purines (-1G, +1A and +2A; +1 represents a predominant start site) 6-8 nucleotides downstream from the -10 region. When any of these start sites is changed to a pyrimidine, that nucleotide was not selected any more as an initiating nucleotide. Changes of a purine to a pyrimidine at -1 site and A to T at +1 site abolish initiation at another purine site, rendering unique initiations at +1A and +2A, respectively. However, when +1 is a pyrimidine, additional base substitution (G→T) at -2 or +5 position causes transcription to initiate at -1G as well as +2A. Transitions of A to G at +1 and +2 sites excluded the initiation at intact two purine sites and at -1G, respectively. When all of the three starting nucleotides are A, the initiation site could not be precisely determined, perhaps because the initial nascent RNA chain slips to the 5' direction. The start sites of the lacUV5 promoter variants carrying a single base substitution within the -35 region and an insertion of C at +5 position were determined by the same method. The primary transcription start sites of these variants shifted from +1A to -1G. However, these shifts are not due to the mutations within the -35 region but to the insertion of C at +5 position. Thus, it seems that E. coli RNA polymerase prefers a purine located at appropriate distance from the -10 region as an initiating nucleotide, and the sequence surrounding the initiation site heavily influences the choice of the start site, while a single base change within the -35 region has little effect on start site selection.
The second, in order to identify and characterize functional amino acid residues of the SP6 RNA polymerase, its gene was first cloned and the cloned gene was randomly mutagenized by polymerase chain reaction under conditions of reduced Taq polymerase fidelity (20mM $MgCl_2$, 1 mM dNTP and pH 8.3 at room temperature). Through the two vector system that permits phenotypic isolation of SP6 RNA polymerase mutants with reduced enzymatic activity, 12 single- and 2 multiple mutants were isolated. Then, the properties of mutant polymerases were analyzed for promoter binding activity, solubility, non-specific catalytic activity, ability to produce short and long RNAs, and recognition of T7 termination signal. The characterization of these SP6 RNA polymerase mutants showed the following: (1) Substitutions of Phe for Tyr684, Ile for Met687, Thr for Ala739, Cys for Gly780, Ser for Pro856 and Glu for Asp862 did not give rise to significant changes in enzyme properties, although the change of Pro856 to Ser resulted in slight changes in processivity and solubility. (2) Arg744 is essential for SP6 promoter binding activity. The Arg744 lies in the same region with the T7 RNA polymerase's Asn748 residue that is involved in discrimination of T7 and T3 promoters. (3) His 779 and His805 are essential for catalytic activity of SP6 RNA polymerase. These His residues are highly conserved in phage RNA polymerases and especially His805 lies in motif C found in many nucleotide polymerases. (4) Two multiple mutants (B66 and D32) retained normal promoter binding activity but lost the catalytic activity, implying that Ser641, Glu671, Phe808, Val820, Ala835, His843 and Met848 residues are not related to the promoter binding, and some of these residues play roles for the catalytic activity. (5) In three mutants (R714P, Q735R and L788P), only a small amount was obtained in soluble form. Substitutions of Pro for Arg714 and Arg for Gln735 resulted in considerable decrease of the promoter binding activity and the loss of catalytic activity, while the change of Leu788 to Pro slightly reduced only the catalytic activity. (6) Two mutant polymerases, A739T and R744H, appear to be more susceptible to protease than the wild type enzyme.
본 연구에서는 대장균 RNA 중합효소의 전사개시위치의 선택을 전사촉진제 요소들의 돌연변이를 통해 연구하고, 파아지 SP6 RNA 중합효소 의 기능에 중요한 아미노산들을 무작위 돌연변이 방법에 의해 규명하였다.
먼저, lacUV5 전사촉진제의 전사개시위치 부분(염기위치 -1, +1, +2)과 -35 부분(염기위치 -36부터 -31까지)의 한 염기의 치환이 대장균 RNA 중합효소의 전사개시위치 선택에 미치는 영향을 체계적으로 연구하였다. 전사개시위치는 시험관내 전사반응에서 CTP 대신에 3'-dCTP를 사용하여, C위치에서 전사가 중단된 RNA의 크기를 측정함으로써 결정하였다. lacUV5 전사촉진제의 전사는 -10 부분으로부터 6-8 염기 아래에 위치한 3개의 퓨린(-1G, +1A, +2A)에서 시작되었다. 이들 개시위치중 어느 것도 피리미딘으로 치환되면, 그 위치에서는 더 이상 전사가 시작되지 않았다. -1 위치의 퓨린이 피리미딘으로 바뀌거나 +1 위치의 A가 T로 변화되면, 각각 +1A와 +2A에서만 전사가 시작되었다. 그러나 +1이 피리미딘일 때, 부가적으로 -2 또는 +5 위치에서 G가 T로 바뀌면, +2A에서 뿐만 아니라 -1G에서도 전사가 시작되었다. +1A가 G로 바뀌면 나머지 두 개시퓨린에서 전사가 시작되지 않았고, +2가 G로 변화되면 -1G에서의 전사개시가 일어나지 않았다. 3개의 개시염기가 모두 A인 경우에는 개시위치를 정확하게 결정할 수 없었는데, 아마도 초기에 생성된 RNA 사슬이 5'쪽으로 미끄러졌기 때문인 것 같다. -35 부분에 한 염기가 치환되고 +5 위치에 C가 삽입된 lacUV5 전사촉진제의 개시위치도 같은 방법으로 결정하였다. 이들 돌연변이체의 주요 전사개시위치는 +1A에서 -1G로 이동되였다. 그러나 이 개시위치의 이동은 -35 부분의 염기 변화 때문이 아니라, +5 위치의 C의 삽입에 의한 것이다. 이러한 결과들로 보아, 대장균 RNA 중합효소는 개시염기로서 -10 부분으로부터 적당한 거리에 위치한 퓨린을 선호하며, 전사개시위치 주위의 염기열이 개시위치의 선택에 심하게 영향을 주는 반면 -35 부분의 염기변화는 거의 영향을 주지 않는 것 같다.
두번째로, 파아지 SP6 RNA 중합효소의 기능에 중요한 아미노산들 을 찾고 관련된 기능을 규명하기 위하여, 먼저 이 효소의 유전자를 cloning하고 Taq DNA 중합효소의 충실도가 감소된 조건(20mM $MgCl_2$, 1 mM dNTP, pH 8.3 실온)에서 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 무작 위적으로 돌연변이를 유도하였다. 활성이 감소된 SP6 RNA 중합효소 돌연변이를 표현형으로 골라낼 수 있는 2 벡터체계(two vector system)를 이용하여 12개의 단일돌연변이와 2개의 다중돌연변이를 얻었다. 그런 다 음, 돌연변이 RNA 중합효소의 전사촉진제에 대한 결합정도, 용해도, 비특 이적 촉매활성, 짧거나 혹은 긴 RNA를 만드는 능력, T7 전사종결제의 인지여부등을 조사하였다. 이들 SP6 RNA 중합효소 돌연변이들의 특성을 파악한 결과 아래와 같은 결과들을 보였다: (1) Tyr684가 Phe으로, Met687이 Ile으로, Ala739가 Thr으로, Gly780이 Cys으로, Pro856이 Ser 으로 그리고 Asp862가 Glu로 치환된 것들은 효소의 특성이 거의 변하지 않았지만, Pro856이 Ser으로 변한 경우는 processivity와 용해도가 약간 감소하였다. (2) Arg744는 SP6 전사촉진제에 결합하는데 필수적인 아미노산이다. Arg744는 T7과 T3의 전사촉진제를 구별하는데 관여하는 T7 RNA 중합효소의 Asn748을 포함하는 부분에 위치한다. (3) His779와 His805는 SP6 RNA 중합효소의 촉매활성에 필수적인 아미노산들이다. 이들은 파아지 RNA 중합효소들에서 매우 잘 보존된 아미노산이고, 특히 His805는 많은 핵산 중합효소들에서 발견되는 motif C에 위치한다. (4) ae? 개 이상의 아미노산이 치환된 B66과 D32는 정상적인 전사촉진제 결합능력은 가지고 있으나, 촉매활성은 상실되었다. 이것으로 보아 Ser641, Glu671, Phe808, Val820, Ala835. His843 그리고 Met848 잔기들은 전사촉진제의 결합에는 관여하지 않지만, 이들 중 몇몇은 촉매활성에 중요한 역할을 할 것이다. (5) 세 가지 돌연변이(R714P, Q735R, L788P)들은 아주 적은 양만이 용해된 상태로 얻어졌다. Arg714가 Pro, Gln735가 Arg 로 바뀐 것은 촉매활성이 상실되고 전사촉진제에 대한 결합도 상당히 감소 된 반면, Leu788이 Pro로 바뀐 것은 단지 촉매활성이 약간 감소되었을 뿐이다. (6) 두 돌연변이(A739T와 R744H)는 야생형 효소보다 단백질 분해 효소에 더 민감한 것으로 보인다.
