The native Korean blood sucking leeches were cultivated in a laboratory. The blood sucking leech has great availability for pharmacological use because of useful anticoagulants, enzyme inhibitors, fibrinolytic enzymes. In this study, an endosymbiotic bacteria that inhabits in the gut of H.nipponia and is responsible for blood digestion was screened. The microorganism isolated from the gut was gram positive coccus type bacteria and appeared streptococcus like. The gram positive bacteria has previously not been known in leech gut. Three different proteases were found from the bacteria, which digested gelatin and one of the three digested casein. The enzyme that digests casein was partially purified by ultrafiltration, DE-52 anion exchange chromatography and Sephadex G-150 gel filtration. The purified enzyme was characterized by inhibitor assay and by substrate digestion experiments. The protease is neutral metalloprotease included zinc ion and endoprotease which acts on globulin-related proteins specifically. This enzyme has 50-60 KDa molecular weight. The enzyme activity was measured using sulfonilamide azocasein as a substrate. Gelatin digesting proteases are being purified. And the caseinolytic protease might be a biologically active protein that digesting blood globulin.
한국산흡혈거머리인 H.nipponia를 실험실에서 대량 사육하는데 성공하였다. 혈전제의 개발을 목적으로 거머리의 인공적인 증식방법을 개발하는 한편, 거머리의 침샘이나 기타 조직에서 합성될 수 있는 혈전 생성억제제ㅈ나 혈전분해효소 및 그외의 기작으로 효율적으로 작용할 수 있는 단백질제제의 개발을 시도하고 있다. 이러한 연구의 일환으로 본 연구에서는 거머리의 장내에서 혈액을 소화와 관련한 단백질분해효소와 공생미생물에 의한 단백질분해효소의 검색을 시도하였다. 이 연구를 통하여 한가지 종의 혈구를 분해하고 최소한 세가지 이상의 단백질분해효소를 합성하는 세균을 분리하였으며 이 균은 기존에 다른 거머리에서 발견된 균과는 다른 특성을 지니고 있었다. LB나 LB에 1\% casein을 첨가한 배지에서 이 균을 키우고 효소의 생성과 분리를 실험하였다. 이 균은 gelatin을 분해할 수 있는 세가지 종류의 단백질분해효소와 casein을 분해할 수 있는 단백질분해효소를 한가지 합성한다는 것을 밝혔다. 그리고 이 중 casein을 분해할 수 있는 효소를 sulfonilamide azocasein을 기질로 하여 측정하였고 또한 30 kDa-UF (ultrafil tration)과 DE-52 음이온 교환, 그리고 Sephadex G-150 gel filtration을 이용한 chromatography로 partial purification하였다. 분리된 효소를 여러가지의 억제인자실험과 기질분해해실험을 한 결과 대략 50-60 kDa의 단백질로 적정 pH는 7.3이고 Zn이온에 의존하는 중성단백질효소이며 특히 globulin계열의 단백질에 특이적으로 작용하는 endoprotease인 것을 밝혔다. 이 효소외의 다른 두 세가지의 단백질분해효소를 분리하고 있으며 이 효소들은 거머리가 혈액을 소화시키는데 있어 면역적인 장애의 극복이나, 응결된 혈액의 분해나 혈전의 제거에 기여하는 특이성을 각각 지닌 유용한 단백질분해효소일 것이라고 예측하고 있다. 본 연구는 앞으로 거머리의 장내에서 생산될 수 있는 fibrin분해효소를 분리하고 그 유용성을 검증할 것이다.
