Peptide GVKGDKGNPGWPGAP (called peptide IV-H1), derived from the protein sequence of human collagen type IV, triple-helix domain residues, represents an RGD-independent, cell-specific, spreading and motility promoting domain in the type IV collagen. The purpose of this study is to improve the cell adhesion activity by the repetition of the IV-H1 peptide. This kind of functional and repetitive polypeptide is biodegradable, biocompatitable and has the property of an absolute stereoregularity. With consideration of codon usage pattern in E. coli and Bacillus subtilis, the IV-H1 peptide-coding oligomeric DNA sequence was designed. For the easiness of the repetition, Nael and Smal site ae localized in the head and tail portion. For the check of the cell adhesion activity and translational stop, tyrosine code and double stop code (TAATAA) lie in separate termination oligonucleotide. The IV-H1 peptide-coding sequence (45 nucleotides) and termination oligonucleotide were chemically systhesized, purified, annealed, ligated into pUC19 cloning vector, and confirmed by the DNA sequencing. By using Nael, Smal and AlwNI restriction enzymes, the IV-H1 peptide-coding sequence was repeated up to the 33-times. By the use of pMAL-p2 expression fusion vector, the expression plasmid, p2-T7 and p2-T17, were constructed, expressed and secreted into periplasmic space in E. coli. Their apparent sizes of the artificial protein on SDS-PAGE gel were in good agreement with the calculated molucular weights (55,632 and 66,982 daltons, respectively).
본 논문에서는 현재까지 알려진 많은 반복 폴리 펩티드 및 블록 펩티드의 배열 중 Type IV 콜라젠의 IV-H1 펩티드를 모델로 하여 그 oligo block nucleotide의 서열을 디자인하고, 그에 따라 합성된 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 대장균에서 생산하는 것이다. 펩티드 GVKGDKGNPGWPGAP(IV-H1 펩티드)는 Type IV 콜라젠에서 RGD와 무관한 , 세포 특이적인 운동 촉진 부위이다. 본 연구의 목적은 IV-H1 펩티드를 반복시킴으로써 세포 접착 역가를 증진시키는 것이다. 이런 종류의 기능성 반복 폴리 펩티드는 생분해성, 생체적합성, 절대적인 광학 규칙성을 갖는다. 대장균과 고초균의 코돈 사용 패턴을 고려하여 IV-H1 펩티드를 암호화하는 DNA의 서열이 디자인 되었다. 반복을 용이하게 하기 위해서 머리 부분에는 NaeI, 꼬리 부분에는 SmaI자리를 두었다. 세포 접착 역가를 측정하고 번역의 종결을 위해 별개의 종결 올리고 뉴클레오티드에 티로신 코드와 정지 코드를 두었다. IV-H1 펩티드를 암호화하는 DNA 서열과 종결 올리고 뉴클레오티드가 화학적으로 합성, 분리, 정제되고 복선화되어 pUC19 클로닝 벡터에 결찰되었으며 DNA 서열 분석을 통해 이를 확인하였다. 독특한 반복 전략을 사용하여 IV-H1 펩티드를 암호화하는 서열을 33번 까지 반복시켰다. pMAL-p2 발현 벡터를 이용하여 9번, 17번 반복된 IV-H1이 대장균에서 생산되어 periplasm으로 분비되었다. SDS-PAGE 상에서 나타난 인위적인 단백질의 크기는 계산된 것과 일치함을 알 수 있었다(55,632 와 66,982 daltons). 현재 반복된 IV-H1 펩티드를 분리, 정제 중이며 앞으로는 세포 접착 역가의 측정 실험이 수행되어질 것이다.
