Escherichia coli ribose-binding protein (RBP), present in the periplasmic space, is synthesized in the cytosol as a precursor form, exported into the periplasm and then processed into the mature form. In order to investigate the pathway of folding in detail, the precursor RBP (pRBP) and mature RBP (mRBP) were purified and their folding behaviors were compared using various spectroscopic techniques. It was found that the native pRBP and mRBP have virtually identical spectroscopic properties. In UV difference spectra between native and denatured states, both proteins showed minima at 286, 278, 269, 265, and 260 nm which are originated from the tyrosine and phenylalanine residues. When both proteins were excited at 280 nm, the maximum fluorescence emission occurred at 303 nm and the main effect of the denaturant was a decrease of about 45\% in fluorescence intensity without any shift in the maximum wavelength. Analysis of the CD spectra for the native mRBP and pRBP showed that these two proteins have the same secondary structures (mRBP : 44\% $\alpha$-helix, 20\% $\beta$-sheet, 12\% $\beta$-turn, 24\% random structure ; pRBP : 44\% $\alpha$-helix, 20\% $\beta$-sheet, 11\% $\beta$-turn, 25\% random structure). Equilibrium-unfolding studies using two different probes showed no difference in the stabilities between these two proteins. Refolding kinetics observed by CD at 222 nm indicated that the folding of RBPs occurs in two stages, and mRBP folds faster than pRBP. NaCl had no effect on the unfolding kinetics of the RBPs. Substitution of the Phe-187 residue of the RBP with a Trp residue made the RBPs less stable. The differences of midpoints and free energy of denaturation between tryptophan-substituted RBPs and wild type RBPs were found to be 0.08 M and 1.9 kcal/mol, respectively. It was also observed that D-ribose refolds partially unfolded pRBP and mRBP into native structures and decreases the unfolding rate of the these proteins. The conformational stabilities of these proteins were found to increase with increasing D-ribose concentration.
주변세포 공간에 존재하는 대장균 리보스 결합단백질은 세포질에서 전구체 형태로 합성되어 주변세포액으로 전송되어 숙성체 형태로 만들어진다. Folding의 진행과정을 자세하게 연구하기 위하여 전구체와 숙성체 리보스 결합단백질을 정제하여 그들의 folding양상을 분광학적인 방법으로 비교하였다. Native상태와 unfolded상태의 전구체 및 숙성체 리보스 결합단백질은 같은 분광학적인 성질을 갖는다. UV difference spectra 에서 두단백질은 그들의 tyrosine과 phenylalanine잔기로부터 나온 286, 278, 269, 265, 및 260 nm 에서 최소값을 나타내었다. 280 nm에서 흡광하였을 때, 두 단백질 모두 최대 형광은 303 nm 에서 나타났고, 변성제 (GdnHCl)의 주된 영향은 형광양의 45\% 감소였으며, 최대 형광 파장의 변화는 관찰되지 않았다. Native 상태의 전구체 및 숙성체 단백질의 CD spectra분석결과로 두 단백질의 2차 구조가 거의 유사함을 알았다 (숙성체 : 44\% $\alpha$-helix, 20\% $\beta$-sheet, 12\% $\beta$-turn, 24\% random structure; 전구체 : 44\% $\alpha$-helix, 20\% $\beta$-sheet, 11% $\beta$-turn, 25\% random structure). 두 가지의 다른 probes를 사용한 평형에 의한 unfolding 실험으로 이 두 단백질간의 안정도에 차이가 없음이 밝혀졌다. 파장 222 nm에서의 CD값에 의한 refolding kinetics결과는 이 두 리보스 결합단백질의 refolding반응이 두 stages로 일어나며, 숙성체가 두번째 stage뿐만 아니라 첫번째 stage에서도 전구체보다 빠르게 folding함을 보여주었다. NaCl은 이 두 단백질의 unfolding kinetics에 영향을 주지 않았다. 리보스 결합단백질의 187번 잔기인 phenylalanine을 tryptophan으로 치환하면 단백질이 덜 안정화됨을 알았다. Tryptophan으로 치환된 단백질과 야생형 단백질간의 변성시의 midpoint와 자유에너지의 차이는 각각 0.08 . 과 1.9 kcal/mol이었다. 또한, 리보스 결합단백질의 리간드인 D-리보스가 부분적으로 unfolding된 전구체 및 숙성체 단백질을 native 구조로 회복시키며, 이 두 단백질의 unfolding 속도를 감소시킴이 관찰되었다. 두 리보스 결합 단백질의 구조적인 안정도가 D-리보스 농도가 증가함에 따라 증가됨을 관찰하였다.