The high-level expression and secretion vector for streptokinase has been constructed. The streptokinase structural gene(skc) was amplified with polymerase chain reaction(PCR) and subcloned into the secretion vector for E. coli, pSTO-E, which contains the strong $T_7$ promotor, ompA signal sequence and $T_7$ terminator. The resulting streptokinase secretion vector pTOS306 was not stably maintained in E. coli BL21(DE3) strain which contains the $T_7$ RNA polymerase gene. Therefore, the ompA signal sequence and streptokinase structural gene was cleaved and subcloned into the another expression vector pKK223-3 which contains the strong tac promoter and rrnB transcription terminator. This newly constructed vector was named as pKOS 307. To test for streptokinase secretion on agar plate. E. coli JM109 carrying pKOS307 was grown on LB-ampicillin plate and the skim milk/human plasminogen overlay test was carried out after IPTG induction. About 1hr after overlay, the clear zone was shown around the colony. When the streptokinase activities were compared in LB-ampicillin media between E. coli JM109 carrying pKOS307 and E. coli JM109 carrying pKS601 without ompA signal sequence, E. coli JM109 carrying pKS601 without ompA signal sequence, E. coli JM109 carrying pKOS307 produced about four times more streptokinases that E. coli JM109 carrying pKS601. After induction of streptokinase expression in E. cole JM109 carrying pKOS307, about 47 kd and 44kd proteins were found to be newly accumulated in cytoplasmic, periplasmic and extracellular fractions and they were identified as streptokinases by western blotting. The growth of E. coli JM109 carrying pKOS307 was not interfered by the expression of streptokinase. When the streptokinase prooduction with growth phase was observed, periplasmic fraction showed the peak production 1hr after induction and about 80\% of total streptokinases were secreted into periplasmic and extracellular fractions. In this case, the streptokinase activities produced 1hr after induction were al little higher than the activities produced by the Bacillus subtilis secretion system recently reported by Kim et al.(1992). The expressed streptokinase was purified to near homogeneity using affinity chromatography. The yield of purification from periplasmic proteins was much higher(61.3\%) than from the cytoplasmic ones.
혈전증치료제로 널리 쓰이고 있는 스트렙토키나제의 대량생산 및 분리정제를 용이하게 함과 동시에 그 3차원 구조 연구를 위한 기초연구로서, 대장균에서 스트렙토키나제를 대량으로 발현 및 분비시키는 벡타시스템을 개발하였다. 스트렙토키나제의 구조유전자를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시킨 뒤 강력한 $T_7$ 전사촉진제($T_7$ promotor)를 가진 대장균(E. coli) 분비벡타인 pSTO-E에 Subcloning하여 얻은 스트렙토키나제 분비벡타 pTOS306은 $T_7$ RNA중합효소를 가진 대장균 BL21(DE3) 균주에서 매우 불안정하였다. 이에 다시 pTOS306으로부터 ompA 신호서열 및 스트렙토키나제 구조유전자만을 잘라내어 강력한 tac 전사촉진제 및 rrnBT1T2 유전자의 전사종결체가 있는 pKK223-3 발현벡타에 Subcloning하였다. 이와같이 새로이 제조된 스트렙토키나제 발현 및 분비벡타를 pKOS307이라고 명명하였다. pKOS307를 가진 대장균 JM109 균주를 LB-ampicillin 고체배지에서 콜로니를 형성시킨 후 IPTG로 발현을 유도하여 Skim milk/human plasmin overlay 시험을 행한 결과 Overlay후 약 1시간 후부터 뚜렷한 Clear zone을 형성하였다. 또한 이 균주를 pKS601(ompA 신호서열℃? 갖지 않은 스트렙토키나제 발현벡타)을 가진 대장균 JM109와 같이 LB-ampicillin 액체배지에서 배양하여 대수기 중기에서 IPTG로 발현을 유도한 후 비교한 결과, pKOS307를 가진 균주가 pKS601을 가진 균주보다 4배이상 더 많은 스트렙토키나제 활성을 생산하였다. 발현 유도 후 세포질, Periplasm 및 세포외 분획에서 생산된 단백질을 SDS-polyacrylamide 전기영동한 결과 약 47kd 및 44kd의 단백질이 새로이 축적되는 것을 관찰하였으며, 항스트렙토키나제 항체로 Western blotting을 실시한 결과 그 단백질이 바로 스트렙토키나제임을 알 수 있었다. pKOS307를 가진 대장균 JM109 균주의 성장은 스트렙토키나제 발현에 의해 영향을 거의 받지 않았으며, 성장시기에 따른 스트렙토키나제 생산을 세포질, Periplasm 및 세포외 분획에서 관찰한 결과, 대수기 중기에서의 발현 유도 후 약 1시간 만에 Periplasm분획에서 최대 스트렙토키나제 활성을 보였으며 약 80\% 정도가 Periplasm 및 세포외 분획으로 분비되었다. 이 시기에서 생산된 총 스트렙토키나제 활성은 김 등(1992)에 의해 고초균(Bacllus subtilis)에서 관찰된 발현량보다
