A gene (estC) coding for a new esterase (esterase III) of Pseudomonas fluorescens was cloned into Escherichia coli JM83. DNA sequencing revealed a single open reading frame with GTG as a translation initiation codon for esterase III. This was confirmed by N-terminal amino acid sequence analysis of the purified esterase protein. The promoter region and a potential Shine-Dalgarno sequence were followed by the coding sequence of the estC gene. The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence cotains the consensus active site sequence, G-X-S-X-G, of serine esterase. The esterase expressed in an E. coli clone was purified by ion-exchange chromatography and gel filtration. The native form of the enzyme consisted of subunits, each with a molecular weight of 41,000. The results of substrate specificity and the inhibitor studies suggest that this enzyme is a carboxylesterase (EC 3.1.1.1) and a serine residue is present at the active site of the esterase.
대장균에 cloning 된 Pseudomonas fluorescens SIK wl 균주의 carboxylesterase(Esterase III)를 encoding 하는 유전자(estC) 의 DNA 염기서열을 분석하였다. EstC 유전자의 개시 코돈은 ATG가 아니고 GTG로부터 시작하는 ORF(Open Reading Frame)가 있음이 밝혀졌고 이것은 정제된 esterase III의 N-termonal amino acid sequence 분석을 통해 확인 되었다. ORF 의 앞쪽에는 Pseudomonas 의 promoter 라고 믿어지는 염기 서열과 Shine-Dalgarno sequence가 존재한다. DNA 염기서열로부터 아미노산 서열을 추정하였을 때 Cterminus 부근에서 carboxylesterase 와 serinr esterase의 active site에서 공통적으로 발견되는 Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly motif가 발견되었다. 플라스미드 pUE892를 갖고있는 형질전환된 대장균으로부터 esterase III를 정제하였다. 이 효소는 주로 세포내에 존재하며, ion exchange chromatography 와 gel filtration을 통하여 부분적으로 순수 정제 되었다. SDSPAGE를 해 본 결과 이 효소의 분자량은 41,000 Da 임이 밝혀졌다. 최대 활성을 보이는 pH 와 온도는 각각 9.5 와 $50\,^\circ\!C$ 였다. 이 효소의 기질 특이성을 결정하는 실험과 PMSF의 저해 효과를 근거로 이 효소는 carboxylesterase(E.C. 3.1.1.1)로 분류되었고 효소의 활성부위 혹은 기질결합부위에 serine 잔기가 있음을 알 수 있었다.