Immobilization of anchorage-dependent animal cells and virus production were investigated using macroporous gelatin microcarriers (K-beads) developed in our laboratory. For the observation of the distribution of cells in K-beads, Vero (Af. green monkey kidney) cells were cultured in spinner. Vero cells reached a final cell concentration of $5.6\times10^6$ cells/ml. The cell density on K-beads was 2-3 times higher than that on Cytodex-3, conventional solid microcarriers, by previous experiment. It was found that Vero cells appeared to be growing and filling up available pores both on the outside and inside of the K-beads by observation with confocal microscope. As a result, K-beads could provide the protection effect of cells against hydrodynamic shear and direct air sparging. Based on a function of Kolmogorov eddy length scale, the smaller eddies (80㎛) showed the detrimental effect on cells in K-beads as compared with 160㎛ of eddies in conventional solid microcarriers. When direct air sparging was introduced into culture vessels, the relative growth extent of cells on K-beads was about 90% up to 1.8cm/sec superficial velocity. However, cells on conventional solid microcarriers were rapidly damaged at 0.3cm/sec superficial velocity.
Since K-beads promised the mass production of anchorage-dependent animal cells, K-beads was applied for the maximization of virus production. In case of Vesicular stomatitis virus (VSV) production system, pH ranged from 6.6 to 8.0 could not show the any difference of VSV production and optimal multiplicity of index (MOI) for virus production was appeared to be 0. 1 and 1.0. K-beads among various matrices tested provided the higest VSV production ($5.7\times10^{13}$ pfu/ml). To increase the virus production, culture media containing various concentrations of serum were added to the culture vessels just before virus infection. The maximum virus production was appeared at 10% FBS. The addition of polycations into virus production systems increased also the attachment rate of virus to the cells, and virus production was increased 3-4 times higher than the control without the addition of polycations. At reduced $O_2$ partial pressure (10%), VSV titre was increased by 130 times higher than the control (21%). The $O_2$ effect was further confirmed in more scaled-up bioreactor (11). The maximum virus titre was appeared to be $4\times10^{15}$ pfu/ml at 10% of $O^2$ partial pressure for VSV. In case of controlling the dissolved oxygen (DO) at 30% during overall cultivation period, virus titre was decreased to $7.2\times10^{12}$ pfu/ml. In cases of CEF (Chicken embryo fibroblast)/NDV(Newcastle disease virus) system, virus production was decreased at lower $O^2$ partial pressure oppositly. When NDV was infected into Vero cells, maximum virus titre was appeared at 1% of $O^2$ partial pressure which corresponded to 20 times higher than virus titre obtained at 21% of $O^2$ partial pressure. It was further conformed with Vaccinia virus with Vero cells. It appeared that virus titre ($2.4\times10^{11}$ pfu/ml) was increased at 10% and 1% of $O_2$ partial pressure. In order to understand the effect of $O_2$ partial pressure on virus propagation, cellular toxicity which can be expressed as a intracellular superoxide level was overcomed by the addition of ascorbic acid. This is one of the strong anti-oxidants. When 0.5mM of ascorbic acid was added to the culture medium, VSV titre was increased by 140 times as compared with virus titre obtained without addition of ascorbic acid.
부착성 동물세포의 고농도배양과 바이러스의 대량생산을 위해 다공성 젤라틴 미립담체를 제조하여 이용하였다. 다공성 담체의 경우 세포가 담체의 내외부에서 자랄 수 있으므로 단위 부피당 높은 표면적을 제공하며, 또한 배양중 배양기내에서 발생하는 전단응력에 대하여 보호막 역할을 할 수 있다.
Confocal microscope 를 이용하여 세포의 담체내외 분포를 관찰한 결과 세포는 주로 담체의 외부쪽에 먼저 부착한 후 담체의 내부로 점차 성장해 가는 것을 알 수 있었다.
Vero - 6 세포의 배양에서 전단응력에 대한 다공성 담체의 보호효과를 Kolmogorove eddy length scale 에 기초하여 살펴 본 결과 다공성 담체의 경우 일반담체인 Cytodex - 3 보다 훨씬적은 eddy (80 - 100 μm) 들에 의해 세포의 성장이 저해되었다. 직접통기시 Cytodex - 3 에서 부착하여 자라는 경우 superficial velocity 가 0.3 cm/$\sec$ 이하에서도 세포의 성장이 저해되었다. 그러나, 다공성 담체에서는 1.8cm/$\sec$ 까지 세포의 성장 정도가 80 - 90% 로 유지되었다.
위와같이 개발된 다공성 젤라틴 미립담체가 고농도 세포배양에 적합함으로 이를 이용한 바이러스 생산 시스템에 대하여 연구하였다. Vesicular stomatitis virus (VSV) 생산을 위하여 바이러스 접종직전 배양액의 pH 를 6.1 - 8.0 의 범위에서 조정하여 살펴본 결과 pH 6.6 - 8.0 에서는 바이러스의 생산양의 차이가 보이지 않았다. 최적 바이러스 접종농도는 0.1 과 1.0 MOI로 나타났다. 다공성 담체를 이용한 VSV 생산시 일반 담체인 Cytodex - 3 보다 바이러스 생산양이 2 - 4 배 증가하였다. 바이러스의 세포에 대한 부착 속도및 부착 농도를 증가시키기 위하여 여러 종류의 polycation 들을 첨가시킨 결과 첨가하지않은 것 보다 바이러스 생산수율이 3 - 4 배 증가되었다. 또한 산소분압효과를 살펴 본 결과 10% 산소분압에서 VSV의 생산수율이 21% 산소분압에서보다 130배가 증가되었다.
다공성 담체를 이용하여 정상세포인 Chicken embryo fibroblast (CEF) 의 배양시 세포의 최종농도가 Cytodex - 3 보다 2 - 3 배 높았고, 또한 Newcastle disease virus (NDV) 의 생산수율도 3 - 4배 증가되었다. 그러나, NDV 에 대한 산소분압효과는 나타나지 않았다. 이 NDV 를 Vero 세포에 접종하여 산소분압효과를 살펴본 결과 1% 산소분압에서 바이러스의 생산수율이 약 20 배 증가하였다. 또다른 바이러스인 Vaccinia 바이러스를 Vero 세포에 접종한후 산소분압효과를 살펴본 결과 낮은 산소분압에서 바이러스의 생산수율이 약 180 배증가하였다. 위의 결과에 대한 이유로 바이러스접종후 숙주세포내에서 superoxide ion 들이 생성되어 바이러스의 생산및 불활성을 일으키는 것으로 판단되어 바이러스접종후 강력한 환원제인 Ascorbic acid 를 첨가시킨 결과 바이러스의 생산수율이 증가하였다.
총괄적으로 세포의 고농도배양 및 바이러스생산 시스템에 있어서 다공성 담체를 이용함으로써 세포의 최종농도를 높일 수 있었고, 바이러스접종후 산소분압을 낮게 유지함으로써 바이러스의 생산수율을 높일 수 있었다.
