A gene for encoding xylanase was cloned from Clostridium thermocellum ATCC 27405 in Escherichia coli and the nucleotide sequence of the gene was determined. A C. thermocellum chromosomal DNA fragment which was expected to contain the xylanase gene was previously inserted in pUC19 and constructed a new plasmid pKM29. However, we have found later that the chromosomal insert in pKM29 was lacking part of the xylanase gene including the translational stop codon. Therefore, re-isolation of an entire xylanase gene from C. thermocellum chromosome was performed using pUC19 as a vector followed by screenings for $MUC^+CMC^_pNPG^_$ phenotypes. The new plasmid obtained was designated pCX64.
The xylanase gene, designated xynX, contained in pCX64 was analyzed for a complete nucleotide sequence using dideoxy chain termination method. The xynX gene composed of an open reading frame comprising 3, 261 bp started with a ATG and stopped with a TAA codon. The molecular weight of protein estimated from the DNA sequence agreed with that of protein produced in Escherichia coli. The A+T content of C. thermocellum DNA was comparatively high, and the 1.6 kb fragment from the C-terminus of xynX gene was not essential for enzyme activity. No typical promoter sequences could be identified in $5^\prime$-noncoding region by sequence homology, and the sequence of ribosome binding site was also found 7 bp upstream from the start codon as the 5-base sequence -GGAGG- complementary with the $3^\prime$-end of Bacillus subtilis 16S rRNA. At the $3^\prime$-noncoding region, there was a sequence having a feature resembling E. coli $\rho$-independent transcription terminator. The calculated free energy of formation for this structure was -15.0 kcal/mol. The xynX encoded enzyme, xylanase X, was highly active on xylan and exhibited activity towards CMC and MUC. The xylanase X hydrolyzed xylan to xylooligosaccharides but showed no activity on crystalline cellulose. The xylanase X behaved as an endoxylanase. A number of smaller proteins with activities towards xylan and MUC were also produced in E. coli. These are considered to be the result of proteolytic degradation of the translated gene product.
A new strain harboring xylanase gene, Bacillus subtilis (pJX18) was constructed, and the maximum activity in the culture supernatant was 6.23 units/ml/$OD_{600}$.
Xylanase 유전자를 C. thermocellum ATCC 27405 로부터 Escherichia coli 내에서 클로닝을 하였고, 유전자의 일차구조를 결정하였다. Xylanase 유전자를 포함할 것으로 여겨진 염색체 절편을 이미 pUC19에 삽입하여 플라스미드 pKM29를 만들었었다. 그러나 pKM29내에 들어있는 염색체 절편에는 번역종결코돈을 포함한 일부분이 결여되어 있었다. 그래서 C.thermocellum 염색체로부터 pUC19 벡터를 이용하여 $MUC^+CMC^-pNPG^-$ 형질들을 보이는 클론을 선별하여 완전한 유전자를 다시 분리하였다. 이렇게해서 얻어진 새로운 플라스미드를 pCX64라고 이름지었다.
pCX64 내에 들어있는 xynX라고 이름지어진 xylanase 유전자의 완전한 일차구조를 분석하였다. xynX 유전자는 ATG 코돈으로 시작되여 TAA 코돈으로 종결되어지는 3,261개의 염기들로 이루어진 구조유전자부위로 구성이 되어져 있었다. 염기서열 결과로부터 추정된 단백질의 분자량과 대장균에서 만들어지는 단백질의 분자량이 일치하였다. C. thermocellum DNA의 A+T 함량은 비교적 높은편이었고, xynX 유전자의 C-말단으로부터 1.6 kb는 효소활성에 필수적인 것은 아니었다. 염기서열을 분석해본 결과 전형적인 프로모터부위는 확인이 되지 않았으며, ATG 코돈으로부터 7개의 염기 앞에서 Bacillus subtilis에서 알려진 리보솜 결합부위 염기서열과 유사한 -GGAGG-염기서열이 존재하였다. TAA 코돈 아랫부위에서는 대장균의 $\rho$-independent 전사종결을 위한 구조를 갖는 염기서열이 발견되었고, 그 구조형성 에너지는 -15.0 kcal/mol로 계산되었다. xynX 유전자에 의해서 만들어지는 효소는 xylan에 대해서는 높은 활성을 보였고, CMC와 MUC에 대해서도 활성을 보였다. 이 xylanase는 xylan을 xylo-올리고당으로 가수분해를 하지만 결정형의 섬유소에 대해서는 활성을 보이지 않았다. 이 xylanase의 유형은 endoxylanase로 보여진다. 또한 xylan과 MUC에 대해서 활성을 보이는 여러 크기의 단백질들이 대장균내에서 만들어졌는데, 이것은 생성된 단백질이 단백질 분해효소에 의해서 분해가 되어져 생겨난 것으로 여겨진다.
이 xylanase 유전자를 포함하는 새로운 Bacillus subtilis (pJX18)을 만들었고, 배양액에서의 최대활성은 6.23 units/ml/$OD_{600}$이었다.
