The conent will be divided into two main chapters : production of transgenic mice carrying human gastrin/SV40 large T antigen fusion genes, and determination of transgene and sex in single mouse blastomere by polymerase chain reaction.
Tissue-specific tumorigenesis can be induced in transgenic mice by the directed expression of simian virus 40 (SV40) large tumor (T) antigen. In an attempt to induce the tumors or cancers in stomach tissues, nine transgenic mice were generated that carried a chimeric gene composed of the SV40 T antigen gene fused to the exon ll of a human gastrin gene including $5^\prime$ and $3^\prime$ flanking sequences. It was presented through germ-line transmission that three transgenic mice were mosaic. The trangene was expressed in all tissues examined by RT-PCR whereas endogenous mouse gastrin transcripts were detected only in stomach and brain tissues of the trangenic mouse. The antral region of transgenic mice (TEX-3 line) exhibited abnormal state in appearance although stomach sections of transgenic mice did not yet show any histological or pathological changes. If tumors or cancers will be developed in stomach tissue of transgenic mice, the animal model will be useful for understanding of tumorigenesis and physiology of the organ.
In this thesis and efficient method for embryo biopsy was developed. The biopsy method includes the following procedures;embryo holding, partial dissection of zona pellucida, squeezing a single blastomere from an embryo, gentle suction the blastomere into the blunt microneedle, and expelling the blastomere from the blunt microneedle.
All of 260 embryos biopsied at 4-cell and morular stage were survivied. Developmental rate of the embryos to normal blastocysts was 93% and 94%, respectively. Blastocysts developed from 4-cell biopsied embryos were smaller than the normal, but were otherwise enentirely typical in appearance. Mean cell number of the biopsied blastocysts were 24.7±5.2 and was reduced more than 10 cell nuclei compared to that of normal blastocysts (38.5 ± 6.1). Thus, differences of mean cell number between biopsied and normal groups were statistically significant (P ＜ 0.0001) Pregnancy rates of biopsied embryos at 4-cell and morular stage were 38% and 45%, respectively. Sex determination of single blastomeres was performed by amplification of mouse Y-chromosome specific DNA sequence using PCR. The ratio between male and female embryos was 53% and 47%, respectively. The sex-determined embryos were transferred to the uteri of pseudopregnant recipients to test the consistency of the assay system. The sex of 27 out of 29 mice developed from male and female embryos agreed with the predicted sex.
To select transgenic embryos, female mice were mated to a male transgenic mouse and embryos were obtained from the females. Single blastomeres were usually biopsied at morular stage as described above and then subjected to PCR analysis. Among 110 embryos assayed by PCR, 45 embryos were judged as transgenic and 61 embryos were determined as non-transgenic. Thus, the transgene in preimplantation embryos could be detected from single blastomeres by PCR.
Bovine embryos at morular stage were also biopsied by the same procedure as described in biopsy of mouse embryos. Then sex of the bovine embryo was determined from biopsied material by amplification of bovine Y-specific DNA sequences by PCR. Four male and four female embryos assayed were individually transferred to the uterus of pseudopregnant recipient cows.
The methods developed for embryo biopsy and determination of sex or transgene could be used for diagnosis of defective genes at the stage of human preimplantation embryos and sexing of domestic animals.
본 논문의 내용은 두개의 장으로 나누어져 있다. 첫째는 사람 가스트린/SV40 large T 항원의 융합유전자가 도입된 형질전환생쥐 (transgenic mice)의 생산에 관한 내용이고, 둘째로는 PCR방법을 이용한 생쥐수정란 할구세포 한개로부터 도입유전자 또는 성의 판별에 관하여 언급하고 있다.
조직특이적 종양발생은 형질전환 생쥐에서 SV40 large T 항원의 발현에 의해 유도될 수 있다. 본 연구에서는 생쥐의 위장에서 종양 또는 암을 발생시키기 위한 시도로서, 사람 가스트린/SV40 large T 항원의 융합유전자가 생쥐 염색체상에 도입된 9마리의 형질전환 생쥐를 생산하였다. 정상적인 생쥐와의 역교배(backcross)를 실시하여 생식세포를 통한 도입유전자의 유전성을 검토하였던 바, 9마리중 3마리는 mosaic 형질전환 생쥐로 판명되었다. 형질전환 생쥐에 있어서 도입유전자는 RT-PCR에 의해 조사된 모든 조직에서 발현되고 있음이 확인되었다. 반면에 내인성의 생쥐 가스트린 유전자는 위장과 뇌조직에서만 특이적으로 발현되고 있었다. 생쥐의 위장조직에서 아직까지 병리학적 이상변화를 나타내지 있지 않을지라도 TEX-3 계통의 형질전환생쥐는 위장의 유문부분에서 외견상으로는 핏줄이 굵어지는 등 종양으로 발전하기 직전에 흔히 나타나는 비정상적인 형태(abnormal shape)를 보여주고 있었다. 앞으로 이들 형질전환 생쥐에서 위의 종양이나 암이 발생한다면, 이 질환모델동물은 위장의 종양발생이나 생리연구에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
한편 포유동물 수정란에 있어서 할구세포 한개를 분리하는 새로운 방법을 개발하였다. 그 방법은 수정란의 고정, 투명대 일부분의 절개, 압착에 의한 할구세포의 밀어내기, 흡입에 의한 할구세포의 분리등의 과정을 포함한다. 4세포기 또는 상실배기 단계에서 한개의 할구세포를 내어준 생쥐의 수정란들은 모두 생존하였으며, 이들 수정란은 배반포기까지의 체외 배양에 있어서 94%의 높은 발달율을 보여주었다. 4세포기에서 할구세포 한개가 제거된 수정란으로부터 발달한 배반포기 수정란의 크기는 정상적인 수정란보다 작았으며, 세포수에 있어서도 약 38개에서 24개로 10개 이상 줄어있음이 관찰되었다. 그렇지만 이들 수정란은 정상적인 배반포기를 형성하였으 며, 이들 수정란을 가친의 자궁에 이식하였을때 38%의 임신율을 나타내었다. 이는 정상적인 수정란의 임신율(42%)과 거의 같은 임신율로 평가되었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, 새로운 방법에 의한 할구세포 한개의 채취는 채취된 나머지 생쥐수정란의 체외 및 체내 발달율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 방법으로 분리된 한개의 할구세포로부터 PCR방법을 이용하여 수정란의 성을 판별하였던 바, 수컷과 암컷 수정란의 비율은 각각 53%와 47%이었다. 이렇게 판별된 수정란을 가친의 자궁에 이식하여 태어나는 산자의 성과 일치하는지를 조사하였다. 그 결과로서, 태어난 29마리중 27 마리가 PCR 방법에 의해 판별된 성과 일치함을 관찰하였다. 또한 형질전환 생쥐 수정란에서 도입유전자의 유무를 상기 방법으로 확인 할 수 있었고, 산업적으로 가치가 큰 소의 수정란의 성도 판별할 수 있었다.
상술한 할구세포의 분리방법과 PCR을 이용한 도입유전자 또는 성의 판별방법은 착상전 사람 수정란에서 결함유전자의 진단 및 가축 수정란의 성을 판별하는데 적용될 수 있을 것이다.
