Legionella pneumophila is a human intracellular pathogen which encodes about 290 effector proteins, which are translocated into host cells through a secretion system. Only a few effector proteins have been shown to manipulate cellular processes during infection while the functional roles of the remaining majority are still unknown. Lpg0393 is an experimentally identified effector protein classified as a hypothetical protein. Through structural analysis using X-ray crystallography, I showed that Lpg0393 contains a Vps9-like domain which activates endosomal Rab proteins Rab5, Rab21 and Rab22. Consistently, Lpg0393 had a guanine-nucleotide exchange factor activity toward the Rab5 sub-cluster members. This study identifies the first case of a bacterial guanine-nucleotide exchange factor activating the endosomal Rab proteins, implying that the activation of these Rab proteins might be beneficial for the intracellular survival of Legionella pneumophila.
레지오넬라 뉴모필라는 Gram-negative bacterium으로, 레지오넬라병을 일으키고 면역력이 약한 사람에게는 폐렴을 일으키는 병원균이다. 폐포대식세포에 의한 식균 작용을 통해 숙주에 들어가면 박테리아는 Legionella-containing vesicle (LCV)을 만들어서 자신을 보호한다. 감염 후 5분 내에 Dot/Icm type IV 분비 시스템을 이용하여 숙주 세포에 약 290개의 이펙터 단백질을 분비하고 소포체에서 골지체로 이동하는 vesicle을 가져와서 LCV를 확장하고 개조하는 작업에 사용한다. 이렇게 만들어진 특별한 식포는 레지오넬라균의 증식을 위한 장소가 된다. 이펙터 단백질 중에 세포 과정을 조정하는 것으로 밝혀진 단백질이 몇몇 있지만 대부분의 단백질은 그 기능이 밝혀지지 않았다. 현재까지는 자가포식을 유도하는 Rab1을 target으로 하는 이펙터 단백질이 대부분이고 VipD가 Rab1이 아닌 Rab5와 Rab22를 target으로 하는 이펙터 단백질로 알려져 있었다. Lpg0393은 컴퓨터 모델링과 실험적 검증을 토대로 확인된 새로운 레지오넬라 이펙터 단백질로, 기능이 밝혀진 단백질 중에서 서열 유사성을 가진 단백질이 없어서 hypothetical protein으로 분류됐었다. 그런데, Lpg0393과 Vps9 domain을 가지는 단백질들의 key residue가 일치하는 것을 확인했다. Vps9 domain은 vesicle trafficking에 관여하는 Rab 단백질 중 endosomal Rab 단백질인 Rab5, Rab21과 Rab22를 활성화시키는 기능을 수행하는 것으로 알려져 있는데, Lpg0393이 실제로 그 기능을 하는지 확인하기 위해서 분자수준의 구조 규명이 필요한 시점이었다.
본 연구는 Lpg0393의 구조를 X-선 결정학 기법을 통해 분자수준으로 규명함으로써 Vps9 domain과 비슷한 구조를 가진다는 것을 확인했다. Asymmetric unit 내의 구조를 봤을 때 homodimer를 이루는 것처럼 보이지만 실제로는 monomer로 존재하는 것을 size-exclusion chromatography를 통해 관찰할 수 있었다. 구조적으로 봤을 때 human Rabex-5의 catalytic core 부분과 가장 유사하여, helical bundle과 Vps9-like domain으로 이루어져 있고 두 domain이 약 90°를 이룬다. 또한, 서열 상으로 보존되었던 key residue들의 구조적 위치도 매우 유사했다. Lpg0393의 α3에 위치한 D41과 α5에 위치한 Y84이 Rabex-5의 α4에 위치한 D313과 α6에 위치한 Y354과 일치했다. 다만, Rabex-5의 경우 helical bundle로부터 서열이 시작되고 Vps9 domain이 6개의 helix로 이루어져 있지만 Lpg0393은 helical bundle이 C-terminus에 있고 7개의 helix가 Vps9-like domain을 이루는 것이 다른 점이다.
Lpg0393이 실제로 Rab 단백질을 활성화시키는지 확인하기 위해 mant-GDP를 이용한 guanine-nucleotide exchange factor (GEF) assay를 수행하여 Rab1과 Rab6에 대해서는 활성을 나타내지 않지만 endosomal Rab 단백질에 대해서는 활성을 나타내는 것을 확인했다. 또한, Lpg0393(D41A)과 Lpg0393(Y84F)를 이용한 GEF assay를 통해 두 잔기가 활성에 중요한 key residue임을 증명했다. 이를 토대로 Lpg0393이 Vps9과 같이 GEF의 기능을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. 다만, 같은 농도의 Rabex-5와 비교했을 때 낮은 활성을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다.
Lpg0393이 세포 내에서 어디에 위치하는지, endosomal Rab 단백질과 같은 위치에 있는지 알아보기 위해 형광단백질을 결합하여 관찰했다. 우선, Lpg0393을 과다발현 했을 때 골지체에 위치한다는 것을 알 수 있었다. 그리고 Rab5의 dominant negative form(S34N)과는 세포 내에서 유사한 위치에 발현되고 constitutively active form(Q79L)과 같이 발현됐을 때에는 서로 다른 양상을 나타내는 것을 볼 수 있었다. 이를 통해, Lpg0393은 비활성화된 endosomal Rab 단백질을 활성화시키는 GEF로 작용한다는 것을 재확인할 수 있었다.
앞서 서술한 연구 내용을 통해 Lpg0393이 Vps9-like domain을 가지는 단백질로, endosomal Rab 단백질을 활성화시키는 역할을 한다는 것이 확인됐고, 박테리아에서는 처음 발견된 GEF라는 점에서 그 의의가 있다. 또한, 기존의 Vps9 domain과 다른 서열을 가졌기에 새로운 GEF를 찾을 수 있는 토대를 마련하였다. 레지오넬라균이 endosomal Rab 단백질을 활성화하는 이유를 실험적 방법을 통해 알아내지 못했지만 아마도 LCV를 확장하는 과정에서 vesicle의 공급을 원활히 하기 위한 조치일 것이라는 가설을 제시하였다.
