Many proteolytic enzymes have a serine residue as a catalytic functional amino acid. These enzymes are called serine protease and they are of extremely widespread occurrence from mammals to microbials. Also they have similar function, similar active site, similar amino acids, and similar three-dimensional structure. Therefore they have been considered in terms of evolutionary relationship.
Eleven trypsins which selected by computer program FASTP were aligned by computer program VAlign. 44 amino acids were conserved and these amino acids were distributed at active site region, C-terminal $\alpha$-helices region, and disulfide bridge region. These regions were important to perform proteolytic activity. Also, as a consequence of pairwise homology from VAlign, the evolutionary tree was inferred.
The bovine pancreatic trypsinogen cDNA have cloned to elucidate the evolutionary relationship of serine proteases. Lambda gt 11 library was plated and screened with anti-trypsin antibody. The one positive clone (lambda gt T) was found and the phage DNA from this clone was prepared and then digested with EcoRI. The insert have about 0.9 kb size.
自然界에 存在하는 蛋白質 分解酵素 중에는 serine을 活性部位로 가지는 것이 대부분이고 이들은 微生物에서부터 高等動物에 이르기까지 매우 多樣하게 存在하고있다. Serine계의 蛋白質 分解酵素는 대부분 活性部位가 같고 一次構造의 連繼性도 매우크다. 따라서 이들은 ancestral gene 으로부터 進化에 의해서 여러種類로 갈라져 다양한 機能을 遂行하고 있다고 여겨진다.
哺乳動物의 경우 이들 serine계 蛋白質 分解酵素 중의 하나인 트립신이 쥐와 人間으로부터 cloning 되었는데 이 硏究에서는 소로부터 트립신을 cloning 하였다.
이 目的을 위하여 먼저 소의 트립신을 토끼에 注射하여 抗體를 얻었다. 이 抗體가 大腸菌에 의하여 生産되는 蛋白質등의 어떤 成分에 binding 하므로 大腸菌을 host로하여 抗體로 screening하는 cloning 方法에 適合하지 않아서 immunoaffinity chromatography를 통하여 트립신에 대한 抗體만을 純粹分離 하였다. 純粹分離된 抗體를 probe로 사용하여 lambda gtll library를 screening하여 하나의 positive clone을 얻었다 (lambda gt T). 이 lambda gt T phage DNA를 뽑아서 EcoRI으로 digestion한 結果 0.9 kb의 insert를 確認 할 수 있었다.
척추, 무척추, 박테리아로부터 뽑아진 11 개의 트립신들이 콤퓨터 프로그램 Valign에 의하여 配列되어지고 pairwise homology로부터 系統樹가 推論되어졌는데 이것은 cytochrom c의 系統樹와 거의 一致한다. 또한 11 종류의 트립신 아미노산 배열중 44개의 아미노산이 보존되어 있다.