Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC-HLCs) have been considered as a promising cell model for predicting drug safety and xenobiotic-induced hepatotoxicity. However, their application has been still restricted because of low expression and activity of drug metabolizing enzymes (DMEs), especially cytochrome P450 (CYP) enzymes. To determine the mechanism underlying limited DME expression in hPSC-HLCs, we investigated epigenetic and transcriptional regulatory factors involve in the regulation of DME expression. Firstly, we analyzed epigenetic regulation in terms of DNA methylation and histone modifications of CYPs in human embryonic stem cell (hESC)-HLCs. Repressive histone modification and DNA methylation was associated with diminished expression of CYP genes in hESC-HLCs. Inhibition of DNA methyltransferases (DNMTs) induced demethylation of the CpG sites of CYP1A1 and CYP1A2, leading to the up-regulation of their transcription. Moreover, combinatorial inhibition of DNMTs and histone deacetylases (HDACs) increased the transcript levels of CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, and CYP2D6. These results imply that limited expression of CYP genes in hESC-HLCs is associated with epigenetic regulatory factors such as DNMTs and HDACs. Next, we investigated the transcriptional activities of xenobiotic receptors, especially constitutive androstane receptor (CAR), pregnane X receptor (PXR), and aryl hydrocarbon receptor (AHR), that are capable of regulating transcription of a large number of DMEs and transporters. We found that low expression of xenobiotic receptors (CAR and PXR) contributes to low activity of DMEs in hPSC-HLCs. Most DMEs and transporters that are regulated by CAR and PXR were transcriptionally down-regulated in hPSC-HLCs. Transcriptional expression of CAR and PXR was highly repressed in hPSC-HLCs, whereas AHR mRNA level was comparable to that of adult liver. Also, ligand-induced transcriptional activation was observed only at AHR in hPSC-HLCs. Promoter hypermethylation of CAR and PXR was associated with diminished transcriptional activities in hPSC-HLCs. Treatment of AHR-selective ligands enhanced transcriptional level of AHR-dependent target genes (CYP1A1 and CYP1B1) by direct AHR-DNA binding at the xenobiotic response element. Thus, AHR seems intrinsically to function as xenosensor as well as ligand-dependent transcription factor in hPSC-HLCs. Furthermore, expression of AHR-dependent target genes was significantly inhibited by an antagonist. These results indicate that hPSC-HLCs are able to screen toxic substances related to the AHR signaling and to identify potential AHR-targeted therapeutics. Taken together, our findings indicate that transcription of DMEs and transporters in hPSC-HLCs is modulated by epigenetic factor as well as xenobiotic receptors. This implies that better understanding of DME regulation including epigenetic and transcriptional control may lead to generation of HLCs exhibiting functionally matured phenotypes in drug metabolism.
본 연구는 인간 전분화능 줄기세포에서 분화된 간세포에서 약물대사에 관련된 효소 및 막수송 단백질의 발현조절에 관련된 후성유전학적 조절 인자와 전사학적 조절인자의 작용기전에 관한 것으로, DNA 메틸화, 히스톤 단백질의 변형, 그리고 전사조절인자의 기능을 분석함으로써 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포 내에서 약물대사 관련 유전자들의 발현이 감소된 원인을 규명하고자 하였다. 간은 인체 내부에서 생성되는 다양한 활성물질뿐만 아니라 인공적으로 합성된 화합물이나 약물을 해독화하여 생체 외부로 배출하는 기능을 하는 주요장기로 알려져 있다. 특히, 900여가지가 넘는 약제들이 간 손상을 초래하는 것으로 알려져 있으며, 간독성은 신약후보물질의 개발 철회 및 약제들이 시장에서 철수하는 가장 흔한 원인으로 보고되고 있다. 하지만, 현재까지 인체 간독성을 정확히 예측하고 연구할 수 있는 실험모델은 제한적이다. 지금까지 간독성 연구는 동물모델을 이용하여 주로 평가되어 왔으나 종간 상이성으로 인해 인체의 독성예측에 많은 한계점이 보고 되고 있다. 또한, 세포모델로 인간 초대배양 간세포가 가장 이상적인 실험모델로 평가되고 있으나, 수량이 제한적이고 세포주간 약물 반응성 및 생존율 등에 대한 균질성 확보의 어려움으로 이용이 제한적이다. 이에 비해, 인간 전분화능 줄기세포는 무한정한 세포의 공급원으로 이로부터 분화된 간세포는 비교적 균질성이 확보되어 있어 간독성 연구에 대체 시험모델로써 가능성을 인정받고 있다. 간독성 평가분야에서 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포의 유용성은 여러 문헌에서 보고되고 있으나, 인간 초대배양 간세포 및 인체 간 조직에 비해 약물대사 관련 효소 및 막수송 단백질의 낮은 발현과 활성은 여전히 극복해야 할 문제점으로 남아 있다. 따라서, 본 연구에서는 인간 줄기세포 유래 간세포에서 억제된 약물대사 관련 유전자들의 발현조절 기전을 이해하기 위해 이에 관련된 후성유전학적 조절 인자와 전사학적 조절인자의 작용기전을 분석하였다. 첫째, 인간 배아줄기세포 유래 간세포에서 후성유전학적 요인이 약물대사 관련 효소들의 발현에 관여하는 지 확인하기 위해, 약물대사 1단계를 매개하는 주요 CYP효소들의 유전자 발현조절에 관여하는 DNA 메틸화와 히스톤 단백질의 수식화를 분석하였다. 이를 통해 인간 배아줄기세포 유래 간세포에서 CYP 효소들은 유전자 발현조절 부위에서 발현억제 표지인 DNA 메틸화 및 히스톤 단백질의 수식화에 의해 발현이 억제되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한, DNA 메틸화와 히스톤 단백질의 탈아세틸화를 조절하는 DNMT 및 HDAC 효소들의 억제를 통해 CYP 유전자들의 발현이 조절됨을 확인하였고, 이를 통해 인간 배아줄기세포 유래 간세포에서 약물대사 관련 효소들의 발현조절에 후성유전학적 조절인자들이 관여하고 있음을 확인할 수 있었다. 둘째, 약물대사 관련 효소 및 막수송체의 발현을 조절하는 주요 전사조절인자인 CAR, PXR 및 AHR의 발현양상과 활성을 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포에서 분석하였다. 발현조절 부위의 DNA 메틸화에 의한 CAR와 PXR의 발현억제는 이들의 주요 표적 유전자인 약물대사 관련 효소와 막수송 단백질의 발현저하를 초래함을 확인하였다. 이에 반해, AHR은 인간 배아줄기세포 및 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포에서 전사조절인자뿐만 아니라 다양한 리간드(ligand)의 센서로써의 본질적인 기능을 수행하고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포가 AHR 신호전달체계를 활성화하여 독성을 유발하는 약물이나 화합물의 스크리닝 및 AHR 표적 치료제의 개발에 유용한 세포모델로 사용될 수 있음을 제시하였다.
최종적으로, 본 연구는 간세포에서의 약물대사 관련 효소 및 막수송 단백질의 발현에 관여하는 후성유전학적 및 전사학적 조절인자들의 작용기전을 이해하는데 도움을 주며, 이를 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포의 약물대사 기능을 개선하여 향후 이들이 인체 간독성 평가 및 예측에 유용한 세포모델로 활용될 것으로 기대된다.