This thesis presents a microgrid hydrogel sheet for generation of multicellular clusters and analysis of
proliferation and drug assays using pancreatic beta cells. A microstructure-based hydrogel construct was employed to study the relationship between spatial specificity and cellular behavior, including cell fate, proliferation, morphology, and insulin secretion in pancreatic beta cells. To achieve effective generation of multicellular clusters in vitro, cell-containing hydrogel membrane was constructed with the adapted grid structure based on a hexagon. Interestingly, homogeneous 3D clustering of MIN6 cells mimicking the structure of pancreatic islets was coalesced into a merged aggregate attaching to the each hexagonal cavity of floating hydrogel grid structure. Additionally, functional improvement of MIN6 multicellular clusters was also assessed by immunostaining, mRNA expression and transplantation, as well as glucose stimulated insulin secretion. On the basis of multicellular response using geometric controlled microgrid hydrogel constructs, it can be applied to a facultative in vitro culture platform for beta cell proliferation study and drug assay. Some antagonistic and agonistic drugs were assessed by the microgrid hydrogel structure under the static culture condition. To verify cellular growth and morphogenesis in the hydrogel construct, optical density and transmittance were also examined in the 3D culture condition. Furthermore, to suggest compatible methods for 3D cellular models with user preference, a 3D cell culture module based on hydrogel sheet was also exploited for the microfluidic multiple assay platform. Through the separation of each procedures such as in vitro culture and in vitro assay, an easily accessible and universally applicable assay platform could be suggested under a single plan of modular hydrogel sheet in accuracy. Consequently, facultative in vitro beta cell proliferation and maintenance as a cell clustering form through the geometric control of hydrogel scaffold can be achieved using a hexagon-grid cell-encapsulated hydrogel membrane. Use of appropriate micropatterns
may facilitate beta cell culture in vitro, which holds promise for development of an in-depth biofunctional assay for scientific research and development of novel drugs for a variety of metabolic diseases.
본 연구에서는 췌장 베타세포의 증식과 약물분석에 이용하기 위한 모듈형 미세그리드 수화젤 시트를 개발하고 이를 응용한 사례를 보여주었다. 특히, 마이크로 크기의 미세그리드 패턴을 함유하고 있는 수화젤 시트를 제작하는 기존의 기술을 바탕으로 췌장 베타세포가 수화젤 주변 환경 및 기하학적 패턴에 따라 세포의 기능 및 증식 정도가 어떻게 달라지는지 관찰하고 분석하였다. 각 미세그리드 수화젤 시트는 배양접시 내에서 고정되지 않은 채 배양되는 것을 특징으로 하였다. 췌장 베타세포는 수화젤 시트 내부에 위치하게 되는데 육각패턴을 기반으로 하여 뚫려있는 그리드 패턴의 수화젤 시트의 경우에 특히, 내부에 고정된 췌장 베타세포가 증식을 거듭하면서 균일한 형태의 다세포 클러스터로 자연스럽게 성장하면서 뚫려있는 그리드 패턴에 맞추어 성장하는 것을 확인하였다. 수화젤 시트 내 어떠한 ECM의 변화나 추가 없이 단순히 마이크로 패턴의 기하학적 양상에 따라 다세포 클러스터의 크기와 균일성, 그리고 효율성이 달라지는 것을 확인하였고, 만들어진 다세포 클러스터의 표면특성을 관찰하였다. 더불어, 베타세포의 성장, 형태변화, 인슐린 분비와 같은 기능적 특성을 확인하고 PCR을 통한 단백질 발현양 분석, 면역염색법을 통한 단백질 발현여부 확인, 마우스 체내이식을 통한 다세포 클러스터의 기능분석을 수행하였다.
췌장 베타세포의 성장을 기반으로 하는 약물분석 시스템을 제안하기 위해서, 최적화된 마이크로 패턴을 가지는 모듈형 미세그리드 수화젤 시트 내 췌장 베타세포의 기본적인 성장패턴을 관찰하였다. 세포생존률 측정을 위하여 염색을 하거나 시약을 통해 증식여부를 관찰하였고, 시간에 따라 증가된 세포의 개수를 직접 측정하는 방식으로도 관찰하였다. 더불어 모듈형 미세그리드 수화젤 시트의 장점을 고려하여 다세포 클러스터가 만들어짐에 따라 달라지는 광투과율 차이를 통해 흡광도 증가율을 비교 분석하였다. 그 결과, 다세포 클러스터가 효율적으로 만들어지는 조건 내에서 흡광도가 선형증가를 나타냈으며, 이는 세포의 직접증가율과 유사한 증가율을 보이는 것으로 나타났다.
이러한 췌장 베타세포의 증식 원리를 바탕으로 모듈형 미세그리드 수화젤 시트에 다양한 약물을 적용하여 그 약물의 독성효과 혹은 증식유도효과를 확인하였다. PCPA나 SB-204,741과 같은 세로토닌 수용기 길항물질의 경우 췌장 베타세포의 성장을 특이적으로 억제시키는 것으로 확인하였고, clozapine과 같은 항정신치료제의 경우, 임상에서 당뇨와 같은 특이적 부작용이 나타나는 현상을 확인하기 위해서 테스트해본 결과 실제 췌장 베타세포의 성장을 억제시키는 것으로 나타났다. 반면, Exendin-4와 같은 GLP-1 유사체의 경우에는 췌장 베타세포를 보호하고 증식시키는 현상을 보이는데 실제 모듈형 미세그리드 수화젤 시트 내에서 배양된 인슐린종 세포에 적용해본 결과 췌장 베타세포가 소량 증가한 것으로 확인되었다. 인슐린종의 경우 세포 성장이 매우 빠르기 때문에 손쉽게 약물을 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있었지만 실제 세포증식을 유도하는 물질은 검출하거나 확인하는 것이 불가능했다. 하지만, 모듈형 미세그리드 수화젤 시트 내에서 배양되는 인슐린종의 경우에는 성장속도를 느리게 유도할 수 있을 뿐만 아니라 주변 수화젤 환경에 의하여 세포가 기능적으로 향상된 형태를 보여 실제 세포증식을 유도하는 물질을 첨가하였을 때 그렇지 않은 경우에 비해 소폭 상승된 결과를 보여주었다.
이 미세그리드 수화젤 시트는 또한 마이크로 플루이딕 시스템과 결합하여 모듈형 세포배양체로서 다중분석장치로 적용할 수 있음을 보여주었다. 물리적으로 약한 미세그리드 수화젤 시트의 특성을 잘 이해하고 최적의 디자인을 가진 마이크로 플루이딕 시스템을 제작하였으며, 이를 바탕으로 모듈형 세포배양체를 결합 및 삽입시키는 방식으로 다중분석과정을 진행하였다. 그 결과, 모듈형 세포배양체 내 고정된 췌장 베타세포들을 마이크로 채널에 따라 각기 다른 시약으로 처리할 수 있음을 확인하였다. 또한, 삽입된 모듈형의 세포배양체를 다중분석장치로부터 분리한 후에는 이전의 미세그리드 수화젤 시트와 동일한 형태로 추가적으로 배양할 수 있었으며 그 결과 염색된 세포들이 다세포 클러스터로 자라나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 다중분석장치를 바탕으로 다양한 농도의 약물을 처리하여 세포의 독성테스트를 간단하게 확인하였고, 다세포 클러스터의 면역염색법 또한 효율적으로 수행할 수 있었다.
결론적으로, 미세그리드 수화젤 시트를 이용하여 췌장베타세포를 균일한 다세포 클러스터 형태로 자연적으로 증식할 수 있도록 유도하였으며, 해당 입체배양체를 바탕으로 세포의 증식과 독성에 관여하는 다양한 약물의 반응여부를 관찰할 수 있었다. 또한, 이 미세그리드 수화젤 시트를 마이크로 플루이딕 시스템 내 삽입형 모듈로서 응용하여 하나의 시트를 통해 다중분석이 가능함을 보여주었다. 결국, 모듈형 미세그리드 수화젤 시트를 이용하여 췌장베타세포의 증식을 이해하고 약물분석을 관찰하여 베타세포를 증식시킬 수 있는 약물을 검출할 수 있는 새로운 개념의 약물분석시스템을 제안하였다. 이는 기존의 당뇨병 치료제와는 차별적인 형태의 약물을 검출해낼 수 있는 시스템이 될 것으로 기대한다. 또한, 베타세포로 분화되는 줄기세포와 같은 특이적인 세포의 체외배양시스템으로서도 응용될 수 있을 것이라 기대한다.
