To clone a thermostable subtilisin-like protease gene, Chromosomal DNA was isolated from various thermophilic $\underline{Bacillus}$ species such as $\underline{Bacillus}$ $\underline{coagulans}$ NRRL B-5666, $\underline{Bacillus}$ $\underline{licheniformis}$ ATCC 27811, $\underline{Bacillus}$ $\underline{stearothermophilus}$ ATCC 12980 and $\underline{Bacillus}$ $\underline{Subtilis}$ JCM 2889. The chromosomal DNA was digested with EcoR I and hybridized using aprA gene from Bacillus subtilis as a probe. The strong signal sized about 6.7kb appeared in B. $\underline{coagulans}$. $\underline{B}$. $\underline{coagulans}$ $\underline{chromosomal}$ DNA digested with EcoR I was electroeluted into 7 fractions and hybridized. F. II showed the positive signal and ligated with pUC9 and transformed into $\underline{E.}$ $\underline{coli}$ JM83. About 8000 transforrmants were screened to obtain recombianat with subtilisin-like protease gene by colony hybridization. Positive signal emerged in three transformants and these are rescreened by Southern hybridization.
여러 고온성 $\underline{Bacillus}$ 균주에서 염색체 DNA 를 분리하고 제한효소, EcoR I 으로 절단하여 Southern hybridization 을 실시하였다. $\underline{B.}$ $\underline{coagulans}$ 의 6.7kb DNA 에서 강한 positive signal 이 나타났다. Hind III 와 Pst I 을 사용해도 signal이 역시 나타났다. EcoR I 으로 절단한 $\underline{B.}$ $\underline{coagulans}$ 의 염색체 DNA 를 크기별로 분획한 후 hybridization 을 하였더니 F.II 에 signal 이 나타났다. F.II DNA 를 EcoR I 과 CIP 로 처리된 운반체, pUC9 과 연결시켜 $\underline{E}$. $\underline{coli}$ JM83 에 형질전환 하였다. 원하는 subtilisin-like protease gene 을 함유하고있는 재조합형 plasmid 를 포함하고있는 colony 를 찾아 내기 위해 형질전환된 대장균을 colony hybridization으로 선별 하였다. 세개의 transformants 에 positive signal이 나타났다. 위의 형질전환체로부터 분리된 plasmid들은 EcoR I 으로 digestion이 되지 않았다. 그리고 Southern hybridization 으로 rescreening 하였으나 positive signal이 나타나지 않았다.
