Homeodomain transcription factors play fundamental roles in the development of organisms. Thus, the total loss of homeobox genes leads to embryonic lethality in most cases, while partial aberration of the protein function is closely linked with many developmental and post- developmental defects. Haplodeficiency of Orthodenticle homeobox 2 (OTX2), a master regulator of head development, exhibits a wide spectrum of developmental defects in human. In mice, Otx2 haplodeficiency shows different ocular and body growth defects depending on genetic background. However, the identity and complication of the factors influencing the background-sensitive defects have yet to be resolved. In the proteomic screening of Otx2 interaction proteins and immunoprecipitation assay using the mouse retina (C57BL/6D2), we identified Acetylserotonin O-methyltransferase (Asmt; also called hydroxylindole O- methyltransferase (HIOMT)). Asmt is known to be one of the genes that are absent in C57BL/6J inbred background, which shows severer defects than C57BL/6D2 background upon Otx2 haplodeficiency. qRT-PCR data suggests both backgrounds transcribe Asmt mRNA, but C57BL/6J background failed to generate a detectable amount of Asmt protein. Moreover, melatonin, the enzymatic product of Asmt, possesses a potent antioxidant activity and is concentrated in the mitochondria where exogenous Otx2 is reported to be localized and function, suggesting a potential cooperation of Asmt and Otx2 in the mitochondria. In support of Asmt in Otx2-supported mouse development, genetic complementation of Asmt into $Otx2^{+/-}$ C57BL/6J background showed a great recovery of ocular phenotypes both in eye size and retinal surrogate marker distribution. Furthermore, melatonin supplement in drinking water reduced incidence of microphthalmia and anophthalmia, but it showed insignificant effects on body size recovery. Therefore, the identification of the roles of Asmt as a genetic modifier of Otx2 enhanced our understanding about the phenotypic penetrance and predisposition that are observed in OTX2 patients, although detailed molecular mechanism of Asmt-supported ocular development should be addressed in future studies.
호메오도메인 전사인자 (호메오단백질)는 생물의 발생에 있어서 핵심적인 역할을 수행한다. 따라서, 호메오단백질 유전자가 두 염색체에서 모두 결실된 경우 대부분의 경우 미발달 치사 표현형이 나게 되며, 호메오단백질의 기능의 일부에 이상이 생긴 경우에는 그 호메오단백질과 연관된 다양한 발생학적 또는 발육기 후기의 질환들을 일으킬 수 있다. 곤충과 포유류를 포함한 많은 동물들의 머리 발달의 주요 조절자로 알려진 Orthodenticle homeobox 2 (OTX2) 또한 동형접합체에서 OTX2 유전자가 모두 결실된 경우, 배아는 머리가 될 신경외배엽이 형성되지 못하여 배아 발생 단계의 초기에 죽게 된다. 반면, OTX2 유전자의 이형접합체 환자는 정상적인 형질에서부터 미발달 치사 표현형에 이르기까지 넓은 스펙트럼의 발생학적 질환들이 발견되는데, 이는 마우스모델의 Otx2 이형접합체에서도 발견되며, 흥미로운 점은 마우스 모델의 종류에 따라 Otx2 이형접합체의 형질에 대한 민감성과 심각성이 차이가 난다고 알려져 있다. 실제로 B57BL/6D2 마우스에서는 외관상 발견되는 안구나 안면 형성 장애가 없었던 반면, B57BL/6J 마우스에서 B57L/6D2 마우스에 비해 무안구증과 소안구증, 두개 및 안면 형성 장애의 발생률이 현저히 증가하였다. 또한, B57BL/6J 마우스는 몸 성장에 있어서도 B57BL/6D2 에 비해 결함이 있었으며, 이러한 몸성장의 결함은 OTX2 환자에서도 보고되는 문제 중 하나이다. 마우스의 유전형에 따라 Otx2 의 이형접합체 형질의 민감성에 차이가 난다는 것은 Otx2 의 기능에 영향을 끼칠 수 있는 유전적 인자가 있을 가능성을 제시한다. Otx2 결함의 형질 발현이 유전적 배경에 의존한다는 것은 오랫동안 잘 알려져온 반면, Otx2 의 이형접합체의 형질에 영향을 미치는 인자의 존재와 그 작용 메카니즘은 아직 연구해야할 과제로 남아있다. 최근, 망막에 작용하는 non-cell-autonomous Otx2 가 미토콘드리아의 integrity 를 향상시킴으로서 세포의 생존에 기여한다는 것이 밝혀졌다. 다만 세포에 보호적인 작용을 하는데 필요한 Otx2 의 양이 극히 미량이라는 점과 TEM 전자현미경 상에서 미토콘드리아 내에 존재하는 Otx2 의 양이 아주 적었다는 점은 Otx2 가 단독으로 미토콘드리아에 작용하기보다는 다른 유전적 인자와 함께 작용할 가능성을 시사하며, 이러한 가정을 토대로 미토콘드리아에서 Otx2 와상호작용하는 단백질들을 찾기 위해 C57BL/6D2 의 망막 용해물에서 Otx2 와 상호작용하는 단백질들을 MALDI-TOF 분석을 통해 스크리닝하였다. 그 결과 Acetylserotonin O- methyltransferase (Asmt; also called hydroxylindole O-methyltransferase (HIOMT))를 가능한 후보군으로 선별할 수 있었으며, 면역침강법을 통해 다시 한번 Otx2 가 Asmt 와 상호작용을 할 수 있다는 것을 알 수 확인하였다. Asmt 유전자는 X 염색체의 의사상동염색체 영역 (pseudoautosomal region)에 존재하기 때문에 매우 높은 돌연변이율을 가지고 있으며, C57BL/6J 를 포함한 많은 실험 마우스 모델에서 그 활성이 결여되어 있는 반면 Otx2 이형접합체의 형질이 심각하지 않은 C57BL/6D2 쥐에서는 특수 단백질 검출 검사법을 통해 그 단백질이 발견되었다. 또한, Asmt 는 Otx2 와 Crx 호메오단백질의 전사 조절 타겟 중 하나로서 Asmt 유전자의 발현 위치는 Otx2 와 밀접하게 연관되어 있다. Asmt 의 세포 보호적인 기능 또한 Otx2 의 상호인자로서 작용하기에 적절하다고 판단된다. Asmt 는 멜라토닌 합성 경로의 마지막 효소로서, 멜라토닌은 강력한 활성종 소거 능력을 가지고 있으며, 멜라토닌의 주요한 작용 위치는 외인성 Otx2 가 작용하는 미토콘드리아로 알려져있다. Asmt 의 전단계 효소인 Aralkylamine N-acetyltransferase (Aanat)가 미토콘드리아에서 발견되었다는 점 또한 Asmt 가 Otx2 와 함께 미토콘드리아에서 작용할 가능성을 제시한다. 면역염색법을 통해 Asmt 와 Otx2 를 트렌스펙션한 후 mitotracker 시그널과 비교한 결과 Asmt 의 시그널은 mitotracker 시그널과 세포핵을 포함한 세포 액상 전체에서 강하게 발견되는 것을 알 수 확인하였지만, Otx2 와의 co-expression 이 Asmt 의 세포내 위치를 변화시킨다는 결정적인 증거는 찾지 못하였다. 이는 Asmt 가 미토콘드리아를 포함한 세포 액상이 아니라 세포핵에서 Otx2 와 함께 작용할 가능성을 시사하며, 앞으로 세포분획법을 통한 단백질 검출과 전자현미경을 이용한 Asmt 단백질의 관찰이 Asmt 의 미토콘드리아 분포에 대한 더욱 정확한 답을 알려줄 것이다. Asmt 가 in vivo 에서 Otx2 이형접합체 형질의 민감성에 실제로 기여하는지 확인하기 위해 C57BL/6J 과 C57BL/6D2 마우스의 안구형성 형질과 몸무게 형질을 비교해보았다. 그 결과, C57BL/6J 마우스에서 Otx2 의 이형접합체 형질이 더욱 심각하게 나타난 것을 확인하였다. 흥미로운 점은, C57BL/6J 아종은 소안구증을 가지지 않은 눈에서 조차, 망막의 다른 층들에 비해 망막 안쪽의 총상층이 특히 감소하였으며 이러한 형질은 Otx2 이형접합체를 Msm- Asmt 로 유전적 보상을 시켜준 결과, 정상 수준으로 회복되었다. 또한, Asmt 유전자가 보상된 쥐에서 망막 이극세포의 대리 표지자들의 분포가 type2-OFF 이극세포 표지자인 Recoverin 을 제외하고 그렇지 않은 경우보다 크게 증가하였다. Asmt 의 대사산물인 멜라토닌이 이러한 Otx2 의존성 질환를 보호하는데 기여하는지 알아보기 위하여 멜라토닌을 임신 기간부터 P80 까지 같이 복용시켰다. 흥미롭게도, 멜라토닌을 복용한 마우스에서 대조군에 비해 무안구증과 소안구증의 발병률이 약 14% 감소하였다. 다만, 몸무게에 있어서는, 오히려 멜라토닌을 복용하지 않은 마우스에 비해 Otx2 이형접합체와 정상쥐 모두에서 몸무게가 통계적으로 유의한 정도로 성별과 유전적 배경에 상관없이 감소하였다. 이는 멜라토닌에 의한 신진대사의 변화, 수면박탈과 보행성 운동의 증가로 인한 문제로 사료된다. 앞으로 Asmt 가 어떻게 Otx2 이형접합체의 형질에 기여하는지에 대한 더욱 자세한 연구가 필요할 것이다. 또한, 멜라토닌이 이미 의약적으로 구강 투여가 가능하다는 점을 생각했을 때, Asmt 와 멜라토닌에 의한 Otx2 민감성 질환에 대한 효과는 앞으로 태어날 OTX2 환자들에게 가장 빈번하게 일어나는 발생질병 중 하나인 무안구증과 소안구증의 발병율을 조기에 예방할 수 있도록 해줄 것이다. 이 연구가 무안구증과 소안구증에 주로 초점을 맞추었지만, OTX2 와 연관된 발생질환에 속하는 소두증과 안면 형성 장애 등의 발생률을 줄이는데에도 기여할 수 있을 것이라 생각한다.
