Intracellular membrane trafficking is a complex conserved aspect of eukaryotic cells. Trafficking events (e.g., transport, tethering, docking and fusion) mediate and participate in diverse intracellular processes. An impairment in any trafficking step can alter cell metabolism, cell polarization, and/or specific signaling pathways and may be associated with severe diseases, including cancer, immunodeficiency, and neurological disorders. Because of the high dynamics and multi-step characteristics, intracellular membrane trafficking is difficult to study in a spatiotemporal manner.
This study is divided into two parts and focuses on the study of intracellular membrane trafficking using a new optogenetic approach. Part I is the development of the system for spatiotemporal targeting and control of various intracellular membranes, using blue-light-induced hetero-interaction between Arabidopsis’s Cryptochrome 2 and CIB1. To target specific intracellular membranes, I utilize several membrane targeting proteins, especially Rab GTPases-the small GTPase family that are well-known as membrane identities. In this system, illumination induces either a rapid recruitment of protein to the targeted membrane, or an aggregation that disrupts the dynamics and functions of the targeted membrane. I apply the tool to specifically perturb several trafficking processes, including lipid modification on the early endosomes, multi-step transportation of receptors, proteins trafficking, secretory pathway and signals initiated from endosomes.
In Part II, I demonstrate the examples of studies that can exploit the advantages of the developed optogenetic system in Part I. In neuronal growth study, I utilize this tool to reveal different functions of local Rab5- and Rab11-mediated membrane trafficking in the growth cones and somas of young hippocampal neurons. The result reveals an important role of Rab5-mediated trafficking in maintaining protrusion rate during the rapid growing stage. In cancer signaling study, I showed that several Rab GTPases localize to the protrusion area in invasive breast cancer cell line, and the potential of using this new optogenetic tool to study distinct roles of different Rab GTPases during tumor cell migration.
In summary, in this study I develop a new optogenetic system to control diverse intracellular membrane trafficking processes. My results prove that the developed system is a versatile tool that can be used to dissect spatiotemporal functions of intracellular membranes in many models, especially in polarized complex such as neurons, and in vivo studies in tissues or whole organisms.
세포 내 막 교환은 진핵 세포에서 잘 보존되어 있는 물질 수송 시스템이다. 막 교환 현상은(예를 들어, 수송, 테더링, 도킹 및 융합) 다양한 세포 현상을 중재하고 참여한다. 막 교환의 특정 단계에 손상이 일어나면 세포 대사, 세포 극성화, 또는 특정 신호 경로를 변경시킬 수 있으며, 암, 면역 및 신경 질환을 포함한 중증 질환과 연관 될 수 있다. 세포 내 막 교환은 매우 역동적이며, 여러 단계로 구성되는 특징을 가지기 때문에 시공적인 (spatiotemporal) 방식으로 연구하기 어렵다는 점이 있다.
이 연구는 두 장으로 나누어 지며, 새로운 광유전학 (optogenetics) 기반의 접근 방식을 사용한 세포 내 막 교환의 연구에 초점을 맞추고 있다. 첫 장에서는 청색광에 의해서 유도되는 애기장대 (Arabidopsis)의 광수용체 Cryptochrome 2 와 CIB1 사이의 이형 상호 작용을 이용하여, 시공적인 표적화 (targeting) 및 다양한 막 구조 세포 소기관의 제어를 위한 시스템의 개발을 다룬다. 특정 막 구조 세포 소기관을 표적화하기 위해서, 몇몇 막 구조 세포 소기관을 표적화하는 단백질, 특히 랩 단백질 (Rab small GTPase)을 사용한다. 이 시스템에서는, 광조사로 단백질을 특정 막구조 세포 소기관으로 빠르게 이동시키거나 특정 막구조 세포 소기관의 역동성과 기능을 방해하는 응집을 유도한다. 이 기술을 특히 초기 엔도좀 (endosome) 의 지질 변환, 수용체의 다단계 운송, 단백질의 수송, 분비 경로와 엔도좀으로부터 시작되는 신호 등을 포함한 막 교환 과정을 교란하는데 적용하였다. 두 번째 장에서는, 첫 번째 장에서 개발한 광유전학을 기반으로 한 시스템의 장점을 활용할 수 있는 연구의 예를 보여준다. 신경세포 성장 연구에서, 이 기술을 어린 해마 신경세포의 세포체와 성장원추에서 부분적으로 Rab5 및 Rab11이 매개 하는 막 교환의 다른 기능을 밝히기 위해서 사용했다. 이번 결과로 빠르게 성장하는 단계 동안에 Rab5가 매개하는 수송이 성장원추의 성장률 (protrusion rate) 을 유지 하는 데에 중요한 역할을 하는 것을 밝혔다. 또한, 암전이 연구에서, 여러 랩 단백질들이 침윤성 유방암 세포주에서 돌출 (protruding) 부위에 분포하는 것을 확인하였고, 새로운 광유전학 기술을 종양 세포 이동에서 서로 다른 랩 단백질들의 역할을 연구 하는 데에 이용할 수 있을 것이라는 잠재성을 제시하였다.
요약하면, 본 연구에서는 다양한 막구조 세포 소기관의 이동 과정을 제어 할 수 있는 새로운 광유전학 기반 시스템을 개발했다. 이번 연구 결과를 통해, 개발된 시스템이 여러 모델 (특히 뉴런 같은 극성화된 복합체), 그리고 조직 또는 전체 유기체의 생체 내(in vivo) 연구에서 막구조 세포 소기관의 시공적인 기능을 분석하는 데에 이용될 수 있는 다목적 기술이라는 것을 증명하였다.
