To immobilize partially purified cephalosporin acylase from Xanthomonas citri IFO 3835, various immobilization methods were tested. From these experiments, adsorption onto bentonite was selected as cephalosporin acylase immobilization method.
From optimization experiments of adsorption conditions, 5 mg betonite/ml and 6-7 mg protein/ml of enzyme concentration were selected as optimum conditions of bentonite adsorption. And adsorption was performed at 20℃ by intermittent stirring at intervals of 5 minutes.
Enzyme immobilized by the above method was investigated for its characteristics. The optimum pH and temperature of immobilized enzyme reaction were identical with free enzyme as pH 6.5 and 35℃, respectively. But immobilized enzyme was more stable than free enzyme in pH change and at higher temperature. Thus the pH profile of immobilized enzyme was broader than free enzyme, and the half lives of immobilized enzyme and free enzyme at 35℃ were 360 hours and 8 hours, respectively. The substrate inhibition by 7-ADCA was reduced by immobilization Namely, the maximum initial reaction rates of immobilized enzyme and free enzyme were obtained at 7-ADCA concentration of 50 mM and 40 mM, respectively.
In enzyme reactor operation, the immobilized enzyme was repeatedly used in a batch type enzyme reactor of stirred tank. By continuous feeding of PGM into enzyme reactor, the conversion ratio was significantly improved when the flow rate of PGM was 1 mM/min at the enzyme loading of 0.5 uit/ml.
Xanthomonas citri IFO 3835 로 부터 부분 정제한 cephalosporin acylase를 고정화 하기 위해 여러가지 고정화 방법을 사용하여 고정화 실험을 수행하였다. 이중 bentonite에 흡착 시키는 고정화 방법이 이 효소의 고정화에 가장 적합하다고 결론을 내렸으며, bentonite 흡착 반응의 최적화 실험으로부터 bentonite 5.0 mg/ml에 대하여 효소단백질 농도가 6-7 mg/ml일 때가 최적 흡착 조건임을 알았다. 또한 bentonite 흡착 반응은 20℃ 에서 수행하는 것이 가장 좋았다.
bentonite에 흡착된 고정화 효소는 유리 효소(free enzyme)와 유사한 최적 온도(37℃)와 최적 pH(pH 6.5)를 보이지만, pH의 변화에 대한 안정성과 고온에서의 안정성이 증가하였다. 고정화 효소와 유리 효소는 35℃에서의 half life가 각각 360 시간과 8 시간으로 큰 차이를 보였다. 고정화에의해 7-ADCA에 의한 기질 저해 현상도 감소하였는데, 유리 효소와 고정화 효소의 최고 초기 반응 속도는 각각 7-ADCA 농도가 40 mM일 때와 50 mM일 때에 얻어 졌다.
고정화 효소를 회분식 교반형 효소 반응기에서 재사용하는 실험을 수행하였는데, 3 번을 재사용할 때의 전환율은 50 % 정도였다. PG에 의한 product inhibition을 제거하기 위해 PGM을 연속적으로 공급하는 실험을 수행하였는데, 효소 사용량 0.5 unit/ml에서 PGM 공급 속도가 1 mM/min일 때 가장 높은 전환율의 증가(1.5배)가 일어났다.
